植物組培中原生質體培養

植物原生質體是去掉纖維素外壁的具有生活力的裸細胞原生質體仍然具有全能性，在適宜的條件下，可經過離體培養得到再生植株。至今已從煙草、胡蘿卜、矮牽牛、茄子、番茄等70多種植物的原生質體再生成完整的植株。

原生質體培養在應用研究和基礎研究上具有重要意義。第一，與完整植物細胞相比，原生質體易於攝取外來的物質，如DNA，染色體、病毒、細胞器、細菌，因此可利用其作為理想的受體係統進行各種遺傳操作，在植物遺傳育種實踐方麵意義重大。第而，由於沒有細胞壁，有利於進行體細胞誘導融合和單細胞培養。第三，可用於細胞表麵的結構與功能的研究，細胞器結構與功能的研究，病毒侵染與複製機理的研究，以及細胞核與細胞質相互關係，植物生長物質的作用、植物代謝等生理問題的研究。

原生質體培養的基本方法包括：材料的選擇與處理、原生質體的分離、純化、培養、誘導愈傷組織和再生植株。

①材料選擇    目前，人們已從多種植物材料中成功分離出植物的原生質體，如葉片、花瓣、子葉、下胚軸、幼根、莖葉、愈傷組織、懸浮細胞等，其中植物原生質體最方便和最普遍的來源是葉片，葉片中的葉肉組織是遊離原生質體的一種經典材料。它來源方便，供應及時，當有明顯的葉綠體存在時也便於在細胞融合中識別。

②材料預處理   預處理不僅可以提高植物細胞的滲透壓，以減少高滲環境的影響，還可以使分離的原生質適應培養條件，提高原生質體的產量和代謝活性等。材料預處理的方法主要有黑暗培養、低溫處理、預質壁分離等。

①機械分離法    首先使稀薄啊發生質壁分離，然後用利刃切開細胞壁釋放出原生質體。此法的主要缺點是：一是原生質體的產量很低、方法繁瑣費力；而是分生組織和液泡化程度不高的細胞不適用。其優點是可避免酶製劑對原生質體的有害影響。

②酶解分離法   植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素、果膠質和少量蛋白質等，細胞之間通過果膠質相連接。酶法分離就是用相應的酶製劑將上述物質分解，以達到分離原生質體的目的。常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、蝸牛酶等。

a、配製酶液。  在原生質體分離時細胞壁一旦去除，裸露的原生質體若處於內外滲透壓不同的條件下，就可能破裂。因此在酶液中必須加滲透壓穩定劑，常用的滲透壓穩定劑有糖溶液係統和鹽溶液係統兩種。

b、分離原生質體。  原生質體分離有兩種方法。一種是兩步分離法，首先把植物材料在果膠酶或離析酶內處理一定時間，使單個細胞分離出來，然後再在纖維素酶中除去細胞壁，最後獲得原生質體；另一種是一步分離法，即把一定量的纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶組成 混合酶液，對材料進行一次性處理，得到分離的原生質體。

經酶解處理後得到一個由原生質體、細胞團和細胞碎片組成的混合液，需要進一步純化。常用的純化方法有：

a、離心沉澱法   利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先行過濾再低速離心，使原生質體沉澱於試管底部。該方法比較簡單，由於原生質體沉澱在一起相互擠壓，常引起原生質體破碎。

經酶液處理的原生質體懸浮液用400目網篩過濾後，濾液經500~1000r/min離心5~6min吸去上清液，用一般洗滌液（如一定濃度的甘露醇）或專用洗滌液（0.45mol/L甘露醇，10mmol/L CaCl₂.H₂O,0.7mmol/L KH₂PO₄,pH5.6）重新懸浮離心，如此重複2~3次。最後收集沉積於試管底部的原生質體。

b、漂浮法   應用滲透劑含量較高的高滲溶液使原生質體漂浮於液麵。該方法能夠獲得比較純淨的原生質體；由於存在高滲溶液對原生質體的破壞作用，僅能獲得少量的完好原生質體。

首先依照離心沉澱收集原生質體，之後將沉澱用洗滌液（3%蔗糖、0.4mol/L甘露醇、1480mg/L CaCl₂.2H₂O）或用11%~23%蔗糖液洗滌離心（400~800r/min,3~10min）2~3次，收集漂浮在溶液表麵的原生質體，最後用培養液洗滌一次。

c、界麵法   采用兩種比重不同的溶液，其中一種溶液的密度大於原生質體的密度，另一種溶液小於原生質體的密度，原生質體即處於兩種溶液界麵之間。該方法可防止因擠壓引起原生質體破碎，原生質體收獲量較大。

首先依沉澱法收集原生質體，再用培養液離心沉澱一次，將沉澱置於2~3ml培養液中懸浮。取10ml離心管加入8ml 18%的蔗糖溶液，再取2ml原生質體懸浮液鋪於其上，以700r/min離心2min，此時大量原生質體集中於培養液與蔗糖溶液之間，輕輕吸取原生質體，再用培養液離心洗滌一次，即可獲得純淨的原生質體。

分離純化後的原生質體需要檢查活力並調整好起始密度後才能進行培養。對於新分離出來的原生質體的活力有以下幾種測定方法。

①形態識別。形態上完整，富含細胞質，顏色新鮮的原生質體有活力。若將形態上正常的原生質體放入低滲洗液或培養基中，可見到分離時縮小的原生質體又恢複原態。一般正常膨大的原生質體都是有活力的原生質體。

②活體染色。用0.1%酚番紅或Evans藍進行染色後即進行觀察，有活力而質膜完整的原生質體對染料有排斥作用而不被染色，死亡的原生質體能立即被染上色。

③熒光染料活體染色。用雙醋酸鹽熒光素（FAD）對原生質體進行染色，染料可自由透過原生質體質膜進入內部，進入後由於受到原生質體內酯酶的分解，而產生有熒光的極性物質熒光素，它不能自由出入質膜，並在膜內堆積。在熒光顯微鏡下可根據產生的熒光，判斷原生質體的活力。

①淺層液體培養   此法是將一定密度（約2Χ10⁵個/ml）的原生質體懸浮液移到培養皿或三角瓶中使之形成一個淺層（1mm）並進行培養。注意液層不宜太厚，否則不利於細胞對氧的吸收。培養期間每日需輕輕搖動2-3次，避免分布不均勻並幫助通氣。本法的優點是培養基與空氣接觸麵大，通氣好，原生質體的代謝物是易擴散，防止了有害物質積累過多而造成毒害。此外，轉移培養物或添加新鮮培養基也方便，並便於觀察和照相。

②平板法培養   將1ml原生質體密度為4Χ10⁵個/ml的懸浮液，與等體積已溶解的含有1.4%瓊脂糖的培養基（40~45℃）均勻混合後，置於直徑為6cm培養皿中，此時密度為2Χ10⁵個/ml，待凝固後，將培養皿反轉，置於四周墊有保濕材料的直徑為9cm的培養皿內。此法得到的原生質體分布均勻，有利於進行定點觀察原生質體形成細胞壁和細胞團的全過程。

③雙層培養法   為固體培養和液體淺層培養相結合的培養方法。在培養皿內注入適量的固體培養基，再加入與原生質體混合均勻的培養液。此法既具有較豐富的培養基，又不易幹枯,並且細胞分裂後可在固體培養基上生長和繁殖.

①細胞壁的再生   分離的健康原生質體在各方麵條件都合適的時候,會很快再生出新的細胞壁.因植物種類、取材的器官或組織的不同，細胞壁開始再生的時間也不同。一般情況下，由培養細胞和幼嫩組織分離的原生質體，再生壁開始再生的時間也不同。一般情況下，由培養細胞和幼嫩組織分離的原生質體，再生壁開始得比較早，而對於葉肉原生質體，則需要較長的時間才能再生出新的細胞壁。

②植株再生   當原生質體形成新細胞壁後，就進入細胞分裂階段，持續分裂的結果就形成細胞團或愈傷組織。由細胞團或愈傷組織再生成完整植株可以通過兩條途徑來完成，一是愈傷組織誘導形態發生；另一途徑是由植株原生質體細胞係在培養過程中直接誘導形成胚狀體，並且可以繼續形成極性，即下端生根、上端分化芽，從而發育成完整植株。

當原生質體再生的愈傷組織長到1-5mm時，可以轉接到分化培養基上。分化培養基與原生質體培養基的區別在於：不加滲透壓穩定劑，隻加蔗糖做碳源；提高細胞分裂素的濃度，降低生長素濃度。在分化培養基產生的苗一般沒有根，需轉接到生根培養基中以促進根的形成。

原生質體融合是指兩種異源原生質體，在一定的條件下相互接觸，發生膜融合、細胞質融合和核融合並形成雜種細胞，進一步發育成雜種植株的過程，也稱體細胞雜交。原生質體融合不僅可以克服植物種屬以上的有性雜交不親和性障礙，進行遺傳改良，同時也為細胞生物學和遺傳學研究提供了一個新途徑。

原生質體的融合方式有自發融合和誘導融合兩類。自發融合是種內融合，融合率不高，融合的個體一般不能進一步發育。誘導融合是指加入誘導劑或用其他方法使二親本原生質體融合，它可以是種內的，也可以是種間，甚至屬間或科間以上的。人工誘導融合的方法有化學融合法和物理融合法兩種。

①化學融合法    主要是用各種化學試劑作為誘導劑，常用的方法有高鈣高PH法，聚乙二醇（PEG）法。

a、高鈣高PH法。這是比較早采用的融合方法，它是以較高濃度的Ca²⁺作為融合劑，誘導原生質體融合。用PH為10.5、Ca²⁺濃度為50mmol/L的溶液，在37℃的條件下誘導兩個煙草品係葉肉原生質體的融合，獲得了種間雜種細胞。

b、PEG法。1974年高國楠和Michayluk用PEG誘導融合植物細胞，使原生質體融合的頻率明顯提高。以後又將PEG誘導與高鈣高PH溶液相結合，可以顯著地提高融合率，有的可高達30%~40%。具體方法是：首先製備兩個不同來源的植物原生質體，按要求的比例1：1到1：4在含滲透穩定劑和鈣鹽的溶液內相混合，然後加入23%~30%PEG，促使原生質體迅速廣泛凝聚，形成團塊。然後開始洗滌，先加入堿性高鈣溶液，接著用培養基洗滌PEG。當PEG被稀釋和被洗滌除去時，發生了融合，而融合產物和原生質體又恢複成球形，轉移到培養基中培養即可。

②物理融合法  主要包括顯微鏡操作、離心或振動、電刺激等來促進原生質體融合。

如微電極法誘導融合是通過插入微電極接通一定的交變電場，原生質體極化後在電場中順著電場排列成緊密接觸的珍珠串狀。此時瞬間施以適當強度的電脈衝，使原生質體膜被擊穿而發生融合。此法基本解決了化學誘導融合劑的毒性問題，具有融合效率高，重複性好，方法簡單，對原生質體傷害小等特點。

雙親原生質體融合時，可分為自體融合和異體融合兩大類。自體融合的結果得到同核體，由不同雙親、原生質體融合得到異核體。與同核體相比，融合後的異核體在人工培養基上分裂分化並不占優勢。通常由於啟動分裂和持續分裂緩慢，而受到同核體的抑製，不能發育成為雜種植株。所以必須建立或設計出一套方法，優先選擇細胞雜種植株。目前，細胞雜種選擇方法主要有互補選擇法、機械分離雜種細胞法和雙熒光標記選擇法。

①互補選擇法

a、白化互補選擇法。該法利用一個葉綠素缺失突變體進行篩選。Cocking（1972）利用白化矮牽牛在限定培養基上細胞分裂、分化成植株，正常矮牽牛在此限定培養基上細胞不能分裂，融合後形成的雜種細胞，在限定培養基上可以通過細胞分裂和分化進行選擇。Melchers(1974)將兩種突變白化苗的細胞經融合互補後產生綠苗選擇到曼佗羅、矮牽牛、煙草等的種間體細胞雜種。此法可以依賴有性雜交知識，可廣泛用於不同親緣關係的融合。

b、營養缺陷型互補選擇法。借助於營養缺陷突變型進行體細胞雜種的互補選擇。有人用煙草抗氯酸鹽突變型和不能利用硝酸鹽（缺乏硝酸還原酶）的突變型，將兩個不同突變型的原生質體融合起來，並把其培養在僅以硝酸鹽作氮源的培養基上，選出了大量雜種體細胞。此法簡單而準確，但不易找到合適的缺陷型親本。

c、抗性互補選擇法。利用原生質體對藥物的不同抗性也用於互補選擇雜種。例如，爬山虎的原生質體在MS培養基上一般不會超過50個細胞就停止生長，而矮牽牛的原生質體卻能在MS培養基上正常分裂分化。但二者對放線菌素的反應又不同，矮牽牛細胞在10μg/L放線菌素D即敏感，爬山虎對其抗性較強。於是在含有10μg/L放線菌素D的MS培養基中，雙方親本都被抑製生長，而隻有雜種細胞能夠進行正常的分裂分化。

②機械分離雜種細胞法    該法就是通過顯微鏡操作的手段直接取出異核體。常用的是含有葉綠體其他色素質體的組織細胞，另一方則選用懸浮培養的或固體培養的細胞，不含其他色素。在異源原生質體融合後能明顯識別。融合一旦發生便馬上可檢出其融合產物。具體方法是利用兩種原生質體形態色澤上的差異，在融合處理後分別接在帶有小格的“Cu-park”培養皿中，每個小格中約有2-3個原生質體。在顯微鏡下可以找出異源融合體，標誌位置長大後轉移到培養皿中培養，測定染色體的變化，比較同工酶的差異等。此法對原生質不要求特殊遺傳背景，得出的結果可信度最大。但在技術操作上難度最大。

③雙熒光標記選擇法   Patnik和Coking等1982年在進行原生質體融合時，親本一方是懸浮細胞來的原生質，因其沒有葉綠體，有異硫氰酸熒光素（FITC）標記時會發出“蘋果綠”熒光；另一親本是含有葉率體的葉肉細胞，會發紅光。二者形成的異核體（雜種細胞）在熒光顯微鏡下會同時發出蘋果綠熒光和紅光熒光，因此可方便地把雜種細胞分揀出來，加以培養。

（3）雜種植株的鑒定

①形態學鑒定   這種方法是鑒定雜種的最準確的方法。因為要在形態上表現出雜種性來，就必須有內部的大量基因的協調活動，而且基因的活動必須和細胞的活動取得了協調。但經愈傷組織途徑再生植株與原生質融合產生的變異很難區別，因此僅以來形態特征來判斷不太可靠，尚需配合其他方法。

②細胞學觀察   應用染色體計數方法、核型分析和顯帶技術以親本為對照，對雜種細胞的染色體數目、大小與形態的變化等進行觀察比較。此法優於形態學鑒定，對親源關係遠的雜種細胞的判斷準確性較好。

③同工酶分析  一般以雙方親本的同工酶譜帶作為對照，雜種細胞都具有雙親譜帶的總和。有時還出現新的譜帶，則說明融合產物是異源性的。應用於分析的同工酶很多，已成功使用的有過氧化物酶、乳酸脫氫酶、脂酶、氨肽酶等。由於植物在不同的發育階段，在不同的組織中，同工酶譜帶本身可以有較大的差異，因此進行這方麵的比較時，應注意取樣的部位和時間要嚴格一致。

④分子標記鑒定   分子生物學技術的進展對於分析體細胞雜種的遺傳構成有重大的促進作用。采用核酸分子雜交、限製性內切酶長度多態性（RFLP）和隨機擴增多態性DNA（RAPD）分析，將使鑒定結果更精確。