植物細胞培養

植物細胞培養是指對植物器官或愈傷組織上分離出的單細胞或小細胞團進行培養，形成單細胞無性係或再生植株，或生產代謝產物的技術。它不僅揭示了高等植物細胞方麵的重大理論問題，而且在實踐上已被廣泛地應用到一些研究和生產領域。

單細胞培養就是對分離得到的單個細胞進行培養，誘導其分裂增殖，形成細胞團，再通過細胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直至長成完整植株的技術。

在細胞培養中，即可從植物器官、組織中分離單細胞，也可以從愈傷組織中分離單細胞。常用的分離方法有：

①機械法    葉組織是分離單細胞的最好材料，在研磨中放入10g葉片和40ml研磨介質(20μmol蔗糖+10μmolMgCl2+20μmol Tris-HCl緩衝液)輕輕研磨之後，將勻漿用雙層細紗布過濾，濾液經過低速離心，遊離細胞就會沉降到試管底部，得到純化細胞。

②酶解法    利用果膠酶、纖維素酶處理，分離出具有代謝活性的細胞，這種方法不僅能降解中膠層，而且還能軟化細胞壁。所以用酶解法分離細胞時，必須對細胞給予滲透壓保護。

③由愈傷組織分離單細胞    將未分化、易碎散的愈傷組織轉移到裝有適當液體培養基的三角瓶中，然後將三角瓶置於水平搖床以80~100r/min振蕩培養，獲得懸浮細胞液。用孔徑200μm的細胞篩過濾，除去大塊細胞團，再以4000r/min速度離心，除去比單細胞小的殘渣碎片，獲得純淨的單細胞懸浮液。

單細胞的培養方法有看護培養、平板培養的微室培養等。

①看護培養法    用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，並使其生長和增殖的方法。此法簡單易行，易於成功，但不能在顯微鏡下直接觀察細胞生長過程。

其培養方法是：把含瓊脂的培養液加到小三角瓶中，使成1cm厚，高壓滅菌後備用。在無菌條件下，取處於活躍生長期的約1cm²大小的愈傷組織塊，安放在三角瓶中固體培養基上的中央部位，並在愈傷組織塊上放一片約1cm²的無菌濾紙片，將其在培養室中放置過夜，使濾紙充分吸收從組織塊滲出來的營養成分。然後將分離出的單個細胞接種到濾紙上麵進行培養。培養基和愈傷組織供給單細胞營養使細胞能持續分裂形成細胞團。一般1個多月後，單細胞可分裂成為肉眼可見的愈傷組織小塊，待2~3個月後即可從濾紙上直接轉移到新鮮培養基上，得到單細胞無性係。

②平板培養法    把單個細胞與融化的瓊脂培養基均勻混合，並平鋪一薄層（1mm）在培養皿底上的培養方法。該方法是選擇優良單細胞株的常用方法，顯微鏡下可對細胞分裂增殖進行全程追蹤觀察。

其培養方法是先從細胞懸浮物中分離單細胞，並將懸浮液中細胞的密度調整到10³~10⁵個/ml，然後和瓊脂培養基按一定的比例混合均勻（40℃），將含有細胞的培養基倒在培養皿中製成平板，用膠帶封口，在25℃的條件下培養，定期觀察。大約3周後即形成單細胞無性係。

平板培養的效果一般用植板率衡量。植板率是指已形成細胞團的單細胞與接種總細胞數的百分比。

植板率=（每個平板中所形成的細胞團數/每個平板中接種的細胞數）Χ100%

③微室培養法    人工製造一個小室，將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。該方法可在暗視野（或相差0顯微鏡下清楚地觀察到活細胞的各種變化，甚至還可以觀察到線粒體的變化。由於培養基少，營養、水分和PH變動大，培養細胞僅能短期分裂。其培養方法是：

a、將洗淨的蓋玻片與載玻片在酒精燈火焰上消毒，冷卻後按蓋玻片大小在載玻片上塗一圈四環素眼膏。

b、將細胞懸浮液滴一小滴在載玻片上，然後在四環素眼膏上放一小段毛細管，將消毒後的蓋玻片蓋在四環素眼膏的框子沙鍋內，使其與眼膏緊密接觸，在蓋玻片與載玻片之間造成一密閉的小室，這小室通過一段毛細管與外界通氣，蓋玻片蓋上後要使它與細胞懸浮液滴相接觸。

c、帶有培養物的微室可以按需要放在培養箱或培養室中，溫度26~28℃，光照或黑暗的條件下進行培養。

d、觀察或照相時一定要在同一溫度下進行。

（3）影響單細胞培養的主要因素

①培養基成分   除去培養基的基本成分外，采用生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養基培養單細胞有時會收到良好的效果。在單細胞培養中，補充生長調節劑是非常重要的，它可以大大提高植板效率。適當調整培養基的PH也能提高植板率。

②細胞密度   單細胞培養要求植板的細胞有一個標準的臨界密度才能促進其分裂和發育，低於此臨界密度，培養細胞就不能進行分裂和發育成細胞團。植板的密度不是一成不變的，它因培養基的營養狀況而改變，即培養基的成分越複雜，營養成分越豐富，那麽植板細胞的臨界度越低；反之，植板密度要求越高，一般要求至少10³個/ml以上。此外，植板率高低也與細胞活力等因素有關。

 

細胞懸浮培養是將離體的植物細胞懸浮在液體培養基中進行培養的一種方式。它是從愈傷組織液體培養技術基礎上發展起來的一種新的培養技術。這些細胞和小細胞團可來源於愈傷組織，也可來自幼嫩植株、花粉或其他組織、器官。懸浮培養能大量提供較為均勻一致的植物細胞，並且細胞增殖速度比愈傷組織快，適合進行大規模的細胞培養，因此在植物產品工業化生產上有巨大的應用潛力。

細胞懸浮培養首先要篩選和鑒定培養的單個細胞，從中挑選出生長快，有效成分高，且適合懸浮培養的細胞株，然後進行逐步擴大培養，最後應用於工業化生產。細胞懸浮培養方法主要有分批培養法、半連續培養法和連續培養法3種。

①分批培養    將植物細胞分散在一定容積的培養基係統中進行培養的方法。在培養過程中除空氣和揮發性代謝物可以向外輸送進行完全交換外，其餘都是在一個封閉係統中進行的。培養基中基質濃度隨培養時間增加而下降，細胞濃度和產物濃度則隨培養時間的增加而增加。

分批培養的特點是細胞生長在固定體積的培養基匯總，當培養基中的養分耗盡時，細胞的分裂和生長就停止了。在整個培養過程中，細胞數的變化呈S形曲線。初期細胞很少分裂，細胞數增加不多，增長緩慢，稱延遲期；中期生長最快，細胞數目迅速增加，增長速率保持不變，稱對數增長期；隨後由於養分供應差和代謝物積累，環境惡化，細胞分裂生長減慢稱減慢期；最後養分基本耗盡，有害代謝物積累，導致細胞分裂停止，直至死亡，稱靜止期。

②半連續培養法   該法是在反應器中投料和接種培養一段時間後，將部分培養液和新鮮培養液進行交換的培養方法。反應過程通常在一定時間間隔進行數次反複操作以達到培養細胞和生產有用物質的目的。此法可不斷補充培養液中的營養成分，減少接種次數，培養細胞所處的環境與分批培養法一樣，隨時間而變化。工業生產中為簡化操作過程，確保細胞增殖量，常采用半連續培養法。

③連續培養法   該法是在培養過程中，不斷抽取懸浮培養物並注入新鮮培養基，使培養物不斷得到養分補充，並保持其恒定體積的培養方法。連續培養的特點是培養過程中不斷加入新鮮培養基，保證了養分的充分供應，培養期間不會發生 營養不足的現象，使細胞保持在對數生長期，細胞增殖速度快，適用於大規模工業化生產。可分為兩種培養類型：

a、封閉式連續培養。排出的舊培養液由新鮮培養液補充，進入的和排出的培養液體積相等。並把排出細胞收集，重新放入培養係統繼續培養，所以培養係統中的細胞數目不斷增加。

b、開放式連續培養。在連續培養期間，新鮮培養液的注入速度等於舊培養液的排出速度，細胞也隨懸浮液一起排出，不再收集流出的細胞。流出的細胞數相當於培養係統中新細胞的增加數，因此，培養係統中的細胞密度保持恒定。

① 培養基    培養基成分對細胞培養的生物量和有用物質含量的提高都有密切關係，要互相協調。最主要是要根據不同種類的培養細胞選擇適當的碳源、氮源。培養基PH為5~6較為適宜。

細胞培養中生長調節物質的數量和種類對次生物質的合成起著重要作用。生長素和細胞分裂素不僅保持細胞分裂的作用，而且不同類別的生長素對次生代謝產物合成有著不同的影響。如加入2，4-D，往往阻止多種植物細胞培養時有用物質的產生，但它卻能顯著提高人參皂甙的產量。

②培養條件   光照時間、光質和光強對培養細胞的生長和有用的物質的生產均有大影響。如芸香愈傷組織在光照下培養，其芳香化合物的含量比暗培養下增加1.5~3.6倍。但光也能抑製某些化合物產生，如藍光和白光能使紫草素合成受阻，萜烯類合成也能被藍光和強白光抑製。

溫度對細胞的生長和有用物質的合成與積累均有一定的影響，細胞培養時一般采用25℃左右的溫度。培養物能與氧氣接觸，有利於細胞的代謝和次生物質的合成。