細菌DNA提取方案

一、水煮模板法——主要用於PCR反應

1、接種單菌落於LB或腦心平板，連續畫線，37攝氏度培養18－24小時。

2、刮取1～2接種環菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鍾。

3、12000轉/分鍾 離心10分鍾，取上清，－20攝氏度保存備用。

操作最簡便，對試劑條件要求低。缺點是純度不夠高，可能會含有RNA、蛋白等雜質。但是作為一般檢測目的的PCR反應模板已經足夠了。

有人稱擴增4kb以下片段都可用此種方法製取模版，編者用此類模板PCR可以擴增到3500bp的片段。編者建議：此法得到的模版保存時間短，強烈建議每月重新製作一次。

二、CTAB/NaCl 法

1、接種一單菌落於5mlLB中,30℃培養過夜,

2、取1ml種子培養液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培養16小時;

3、5000r/min離心10分鍾,棄去上清。

4、加入10mlTE離心洗滌後,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20℃保存備用。

5、取3.5ml菌懸液,加入184μl10%SDS,混勻,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1小時

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混勻,65℃溫育10分鍾。

7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鍾,保留上清。

8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),混勻,10000r/min離心5分鍾,保留上清。

9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鍾,收集DNA沉澱,用70%乙醇離心洗滌DNA沉澱。

10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20μg/mlRNaseA,4℃保存。

CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜質較少，保存時間長，編者更喜歡把終濃度為20μg/ml RnaseA加在第5步溫育的時候，這樣最後沒有RnaseA汙染。每一步操作細致一些，得到的DNA可用於Southern blot。
編者建議：長時間保存DNA可放於-20℃，但要盡量減少反複凍融，否則影響DNA質量。

三、鹽析法

1、1.5ml對數期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混勻充分，12000rpm 10min

5、上清用粗槍頭取至新管

6、等體積酚充分混勻，12000rpm 3min，反複抽提至無蛋白層

7、取水層，等體積氯仿混勻，12000rpm 3min

8、上清至新管，2倍體積預冷無水乙醇

9、-20C，20min，14000rpm， 15min

10、400ul 70%冷乙醇洗滌

11、幹燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min

12、2倍體積無水乙醇沉澱，70%冷乙醇洗滌

13、幹燥，溶於100ul TE

介於方法一和方法二之間，CTAB雖然取出糖分效果較好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放棄了CTAB。

革蘭氏陽性菌，由於細胞壁的結構與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。

實驗注意：提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以後在酒精燈上迅速過一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷基因組！抽幹時最好是風幹！

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