關鍵詞:植物組織培養，褐變，對策
目前，在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑製作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防範措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1 褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是複雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
1.1 植物種類及基因型 不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
1.2 外植體部位及生理狀態 外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
1.3 培養基成分 培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關係。
1.4 培養條件 溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
2 褐變產生的機理
2.1 非酶促褐變
非酶促褐變是由於細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，並不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2 酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、芸香苷等），但並非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在並不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由於多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一係列的脫水、聚合反應，最後形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3 防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑製:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑製有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
3.1 適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周後長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
3.2 對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水衝洗後，在2
3.3 適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
3.4 添加褐變抑製劑和吸附劑
褐變抑製劑主要包括抗氧化劑和PPO抑製劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由於其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限製。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 +結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑製多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等, 從而有利於培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1
3.5 進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天後應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑製作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
參考文獻：
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