紅曲米中七株紅曲黴純培養的分離鑒定

關鍵詞：紅曲米；紅曲黴；分純；鑒定 

中圖分類號：TS201.3                        文獻標識碼：A

自1884 年Van Tieghen 首次分離出紅曲黴，至今已有百年的曆史。近幾年紅曲黴的許多功效相繼被證實後，紅曲菌的相關專利陸續出現。自1975年至1997年為止各國關於紅曲黴的專利將近200 篇^[1]。目前紅曲色素應用是紅曲研究的主要方向，近20年有近40%的專利都在此領域。1979 年紅曲黴被發現可產生膽固醇合成抑製劑，紅曲黴降血糖、血壓及膽固醇功效即成為眾人關注的焦點 ^[2]。

另外作為食品添加劑也是紅曲應用的主要方向，有關添加紅曲成為功能性食品的專利有31篇，且多在日本申請。還有用於生產各種酶的專利15篇，以及在化妝品、處理廢水、飼料上的應用^[3]。對紅曲黴的研究已從紅曲色素擴展到有關降血壓、血糖及膽固醇，紅曲黴抗菌作用等多個方麵。

本論文報道了對廣西所產紅曲米中紅曲黴的分離純化工作。對廣西武宣一帶的紅曲米中的紅曲黴進行分純，得到了7個純培養，進行了屬的鑒定。發現其中一株有較為突出的抗菌能力（另文發表）；還有一株有較為突出的產紅曲色素能力。研究成果擴大了紅曲黴的菌種庫，為發掘紅曲黴生物資源做了有益工作。

1  實驗材料

1.1  紅曲米：取自廣西武宣地區，是居民製作紅糟酸所用的發酵劑。

1.2  培養基：富集活化液：12⁰Bx米曲汁900mL，乳酸7mL，無水乙醇100mL，於121℃滅菌20min，使用時以無菌操作加入30ppm鏈黴素。分純培養基: 12⁰Bx米曲汁900mL，6％NaCl，2％瓊脂，121℃滅菌30min。

2  研究方法

2.1  紅曲黴的分純與鑒定：取紅曲米25粒放入100mL富集活化液中，30℃培養５天。采用

米曲瓊脂汁培養基，對數稀釋傾注法分純。以無菌操作將生長迅速、健壯的菌落，挑取放到

富集活化液中繼續富集活化，待培養5天後重複上述分純操作，經過多次操作就可以分離得

到紅曲黴純培養。

    通過菌落形態、菌絲體形態觀察，耐酒精、耐NaCl實驗，進行紅曲黴純培養的鑒定。

2.2  紅曲黴產紅曲色素的研究：用米曲汁培養基，遮光，32℃，160r/min 培養六天。用分光光度法測定總色價。

3  實驗結果

3.1  紅曲黴的富集活化

活化培養的第二天，紅曲米開始有附著的白色菌絲；第三天紅曲米上浮，米身附著大量菌絲；第四天紅曲米全部上浮，菌絲開始粘連；五天以後出現白色菌膜；七八天後白色菌膜轉變為紅色。根據菌體質量測定，紅曲黴生長對數期大約處於第五、第六天，最適合用作接種材料。

3.2  紅曲黴的分離鑒定：

3.2.1  菌落形態特征。紅曲黴培養初期都為白色小菌落，經過培養後，菌落開始老熟，表麵的顏色變化比較豐富，有的菌落顏色開始改變，逐漸變成橙色、淺藍色、灰色、鉛灰色和灰白色等；菌落的主要形狀為皮膜狀和絨毯狀，大多菌落有放射狀的溝紋，邊沿一般比較整齊。得到7個純培養，菌落特征見表1。

表1　 7株紅曲黴純培養的菌落形態

菌株   菌落大小   正麵形態      皺折      顏色    側麵觀     背麵顏色     

編號    (mm)                                  

M-1     38       圓形絨墊狀    輻射狀     紅色      凸起      深紅色

M-2     20       圓形皮膜狀    有皺折     白色     不凸起      紅色      

M-3     38       圓形絨墊狀    輻射狀     橙色      凸起       橙色

M-4     40       圓形皮膜狀    輻射狀     白綠灰^①不明顯      橙色

M-5     29       圓形皮膜狀    不明顯     白鉛綠^②  不凸起      橙色

M-6     20       圓形皮膜狀    不明顯     白綠^③    不凸起      橙色

M-7     42       圓形絨墊狀    不明顯     白色     不凸起      橙色

注:①菌落從裏至外為三個色環，顏色依次為灰色、綠色和白色；②菌落從裏至外為兩個色環，顏色依次為灰色和白色；③菌落從裏至外為兩個色環，顏色依次為綠色和白色。

3.2.2  個體形態特征。30℃培養3天的紅曲黴純培養，用手術刀切取大小約1×1ｍｍ的菌苔，製成水浸片，鏡檢觀察個體形態，7個菌株均觀察到細胞橫隔，有足細胞，梨形的分生孢子，有的還觀察到閉囊殼結構．

3.2.3  曲黴純培養的分類

根據以上形態觀察結果，將７株純培養鑒定為紅曲黴屬^[4]。

根據1992年ATCC真菌目錄，紅曲黴菌主要可分為三大類。按照文獻的檢索方法對所得的7個菌株進行測定後，分類結果見表2。

表2  ７株紅曲黴純培養的分類結果

類別          MEA上菌落直徑（mm）       色素顆粒        菌株編號

 M.purpureur         < 28mm                 有             M-2 M-6 M-1

M.pilosus           > 28mm                 有             M-3 M-7

M.ruber             > 28mm                 無             M-5 M-4

M-1、M-2、M-6屬於紫色紅曲黴類(M.purpureus)，M-4、M-5屬於紅色紅曲黴類(M.ruber)，M-3、M-7屬於叢毛狀紅曲黴類(M.pilosus)。 

3.3  M-1的紅曲色素產生能力

分純過程中發現M-1菌株的菌落及其培養液顯示出突出的紅色。我們對其進行了種的鑒定和紅曲色素產生能力的測定。

          3.3.1  根據PDA平板上30℃培養7天的結果和耐乙醇、NaCl特征可以對M-1菌株進一步分類，結果如表3所示。

表3  M-1菌株的分類特征

菌株      形成      菌落      分生孢子     產色素     耐30％     耐6％

代號     閉囊殼     形狀       鏈形狀                  乙醇       NaCl

M-1       否       溶岩狀      螺旋        產生      不耐        不耐

根據檢索表^[5]，將M-1菌株鑒定為M.purpureus Wen紫色紅曲菌。

3.2.2  M-1、M-2、M-3、M-4產紅曲色素的能力

米曲汁培養基，32℃，160r/min遮光培養六天。用分光光度法測定總色價。結果見表4。

表4  M-1，M-2 ，M-3， M-4菌株產色素能力對比

菌株        Ｍ－１          Ｍ－２           Ｍ－３         Ｍ－４

第一次      146.6           89.8             62.1            62.5

第二次      143.3           83.8             57.3            59.2

第三次      142.6           81.3             60.8            57.1

平均       144.2           85.0             60.1            59.6

可見M-１菌株產紅曲色素能力十分突出，發酵液總色價為144.2μ/mL。

4  結論

4.1  從廣西武宣紅曲米中獲得了7 個紅曲黴純培養。M-2、M-6、M-1屬於紫色紅曲黴類(M.purpureus)，M-5、M-4屬於紅色紅曲黴類(M.ruber)，M-3、M-7屬於叢毛狀紅曲黴類(M.pilosus)。

4.2  成功篩選到一株發酵液總色價為144.2μ/ml的紅曲黴菌株M-1。經形態觀察和耐酒精、耐NaCl能力實驗鑒定為紫色紅曲黴（M.purpureus Wen）。說明廣西武宣地區的紅曲米中的紅曲黴在產生紅曲色素方麵具有較高的研究潛力。

4.3  關於M-1號菌株所產色素的成分、性質還有待進一步研究和探討。以M-1作為出發菌株，通過誘變育種和基因工程，開發紅曲色素生產菌株具有研究價值。

參考文獻

[1] 陳彥霖,李昭蓉,陳建州等.紅曲菌種的研究開發與應用[J].食品工業月刊(台),1998,30.

[2] 路秀玲,趙樹欣,宮慧梅.紅曲黴的應用研究現狀與展望[J].食品科技,2001,(1):43-46.

[3] 賈波,周立平.紅曲黴研究之現狀及發展前景[J].中國食品添加劑,2002, (6):32-35.   

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1979:129-136.

[5] 戴芳瀾.真菌的形態和分類[M].北京:科學出版社,1987.3.

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