青黴遺傳轉化係統的研究進展
邢 偉（西南大學藥學院，重慶 400716）
【摘 要】 青黴在自然界中是普遍存在的,在工業、農業和醫藥領域有著重要的應用和研究價值。有關青黴的遺傳轉化體係已經建立。本文就青黴的轉化方法、轉化載體啟動子的選擇、選擇性標記，及其在青黴研究中的應用進行了綜述。
【關鍵詞】 青黴，遺傳轉化，載體
青黴是真菌中的一大類群,包括一些重要的工業生產微生物，能夠產生許多有生物活性的小分子次級代謝產物，如青黴素。但是，這些活性物質是微生物發酵的次級代謝產物，其產量往往較低，因此需要通過改良菌種等策略來提高其產量。分子生物學、基因工程技術的發展，為構建基因工程菌株提供了可能，給菌種改良工作帶來了更加直接的有效的方法。
遺傳轉化是人們進行菌種改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途徑。自1973年Mishra 和Tatum首次報道粗糙脈孢菌轉化以來[1]，絲狀真菌遺傳轉化係統研究發展非常迅速，絲狀真菌的遺傳轉化係統已基本建立。關於青黴屬真菌的遺傳轉化也有報道。本文著重在青黴屬絲狀遺傳轉化係統的最新進展方麵作一介紹。
1 轉化方法
1.1 原生質體轉化方法
采用酶法消化細胞壁製備原生質體，利用原生質體作為外源基因的受體細胞，是克服細胞壁障礙的有效方法之一。目前常用的細胞壁裂解酶為 Novozyme 234、纖維素酶和蝸牛酶等。Nara等人[2]已經建立了美伐他汀產生菌桔青黴的原生質體轉化係統。而且，他們發現原生質體轉化效率受到包括PEG、二甲基亞碸(DMSO)和肝素等多種因素的影響。PEG的濃度對於轉化效率有顯著的影響，而且是非線性關係。與PEG4000相比，PEG8000更有利於轉化效率的提高。DMSO對轉化具有抑製作用，肝素則能顯著促進轉化。另外，在其他青黴種屬中，相應的原生質體轉化體係也已建立。如產黃青黴[3]、草酸青黴P8[4]、微紫青黴菌[5]。
1.2 農杆菌介導的青黴遺傳轉化方法
農杆菌介導轉化方法ATMT 最初多用於植物遺傳工程。近來ATMT轉化技術已擴展到絲狀真菌，Groot等[6]利用ATMT成功轉化了多種絲狀真菌。
在青黴中，孫傳寶等人[7]利用ATMT方法，通過根瘤農杆菌LBA4404 Ti質粒介導建立一個高效的產黃青黴遺傳轉化體係。利用根瘤農杆菌介導轉化產黃青黴孢子時需要有乙酰丁香酮誘導，但轉化菌絲體時乙酰丁香酮不是必要的, 但一定濃度的乙酰丁香酮可提高轉化率。與原生質體轉化法相比可提高轉化率10倍左右。ATMT轉化法獲得的轉化子在生理特性上原始菌株表型相同。
根癌農杆菌介導的絲狀真菌遺傳轉化是近年建立起來的一種新方法,克服了原生質體轉化的缺點，農杆菌介導轉化法具有四個特點:一是受體來源廣泛，原生質體、孢子、菌絲和子實體都可以直接用於轉化；二是轉化穩定；三是轉化效率高；四是單拷貝插入。隨著ATMT轉化絲狀真菌種類逐漸增多，ATMT已經成為絲狀真菌遺傳轉化的重要手段
2 青黴轉化載體的選擇標記基因
2.1 營養缺陷型互補基因
營養缺陷型互補基因是通過轉入的標記基因與受體細胞缺陷基因互補,使受體細胞表現野生型生長而作為選擇標記的。目前,常用於青黴轉化的營養缺陷型互補基因有產黃青黴的trpC基因（編碼色氨酸合成酶）和pyrG 基因（編碼尿嘧啶營養缺陷型互補基因）等[8]。由於使用營養缺陷型標記要求有特定營養缺陷型受體菌, 因而限製了這一選擇性標記的使用。
2.2 抗生素抗性基因
抗性基因的轉入可以使受體細胞在一定的藥物濃度下生長，表現出藥物抗性,不要求受體菌具有營養缺陷型,使用起來較為方便,促進了藥物抗性標記在青黴等絲狀真菌轉化中的應用。常用抗性標記有：潮黴素抗性基因，腐草黴素（phleomycin）抗性基因，苯菌靈抗性基因(Benr)，博來黴素(bleomycin) 抗性基因。HygB已用於篩選桔青黴和草酸青黴菌P8轉化子[2,4],得到了抗藥性穩定的轉化子。Benr用於微紫青黴菌菌株GXCR的遺傳轉化[5]。博萊黴素和腐草黴素抗性基因在產黃青黴中得到應用[3,7]。
2.3 綠色熒光蛋白
綠色熒光蛋白GFP是從水母體內發現的一種發光蛋白綠光，這種發光的標簽已廣泛應用於遺傳學，生化學和分子生物學。張磊等人[4]構建了綠色熒光蛋白和潮黴素抗性雙標記載體轉化草酸青黴菌P8，篩選出穩定、高效表達GFP並對潮黴素產生抗性的轉化菌株。
3 青黴轉化載體啟動子的選擇
由於啟動子在不同生物間的種屬差異，載體中的真核啟動子必須是來源於受體菌自身或相近種屬。
目前，用於青黴轉化的真核啟動子主要有：來源於構巢曲黴的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動子PgpdA、色氨酸合成基因trpC的啟動子PtrpC[9]和磷酸甘油酸激酶啟動子Ppgk[2],來源於泡盛曲黴的穀氨酸脫氫酶啟動子Pgdh[8]，粗糙脈胞黴氨基酸合成交叉途徑控製基因cpc的啟動子Pcpc[9]，產黃青黴異青黴素N合成酶（IPNS）基因pcbC的啟動子Pipns[9]。這些啟動子在青黴中均有活性，但是它們啟動基因表達的能力有較大差異。任誌紅[9]等對幾種啟動子在產黃青黴中效率評價,結果發現四種啟動子的強弱的順序為PgpdA>Pcpc>Pipns>PtrpC,研究結果也表明選擇性標記基因受強啟動子驅動可以提高產黃青黴工業生產菌種的轉基因效率。
4 青黴遺傳轉化係統的應用與展望
青黴遺傳轉化係統的建立為人們從基因水平研究絲狀真菌的基因功能和菌株改造提供了條件,通過轉化把外源基因導入絲狀真菌細胞,構建基因缺失突變體或高表達菌株，來分析基因的功能及其表達調控機理，以及改良工業業生產菌株。例如，在桔青黴中[10-11]，通過遺傳操作，對美伐他汀生物合成基因簇中的各個催化步驟相關酶基因功能研究及其途徑特異性調控因子MlcR的功能研究，及高產基因工程菌的培育。通過構建laeA基因沉默或高表達菌株，研究表明全局性調控因子laeA對產黃青黴中青黴素的生物合成有正調控作用[8]。
參考文獻
[1]Mishra N C and Tatum E L.Non-Mendelian inheritance of DNA-induced inositol independence in Neurospora.Tech Tips Online,1973,70:3875-3879.
[2]Nara.F,Watanabe.I,Serizawa.N.Development of a transformation system for the filamentous,ML-236B(Compactin) producing fungus Penicillium citrinum.Current Genetics,1993,23(1):28-32.
[3]王富強,任誌紅,徐平等.產黃青黴轉化載體pPIPKA 的構建及青黴素工業生產菌株的轉化研究[J].菌物學報,2004,23(1):66-72.
[4]張磊，範丙全,黃為一.綠色熒光蛋白和潮黴素抗性雙標記載體轉化草酸青黴菌P8的研究[J].微生物學報,2005,45(6):842-845.
[5]玉榮,賴洪敏,劉楊等.高抗重金屬鹽的微紫青黴菌( Penicillium janthinellum)菌株GXCR的遺傳轉化[J].廣西農業生物科學,2008,27(1):31-36.
[6]de Groot MJ,Bundock P,Hooykaas PJ,et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nat.Biotechnol,1998,16(9):839-842.
[7]孫傳寶,朱春寶,朱寶等.利用根瘤農杆菌LBA4404 Ti質粒介導高效轉化產黃青黴及克隆vgb基因[J].中國抗生素雜誌,2002,27(2):87-92.
[8]Katarina Kosalkova´,Carlos Garcı´a-Estrada, Ricardo V.Ulla´n,et al.The global regulator LaeA controls penicillin biosynthesis,pigmentation and sporulation,but not roquefortine C synthesis in Penicillium chrysogenum.Biochimie,2009,91(2):214-225.
[9]任誌紅,徐平,王富強等.產黃青黴工業生產菌種基因報告係統的構建及啟動子效率的評價[J].菌物學報,2005,24（3）:376-384.
[10]Abe,Y.Suzuki,T.Ono,C.Iwamoto,K.Hosobuchi,M.Yoshikawa,H. Molecular cloning and characterization of an ML-236B (compactin) biosynthetic gene cluster in Penicillium citrinum.Mol Genet Genomics,2002,267(5):636-646.
[11]Baba,S.Abe,Y.Ono,C.Hosobuchi,M.Targeted disruption of the genes,mlcR and ariB,which encode GAL4-type proteins in Penicillium citrinum.Biochim Biophys Acta,2006,1759(8-9):410-416.
上一篇：醋酸杆菌最佳誘變劑的篩選
