食品中大腸菌群兩種測定方法的比較

食品中大腸菌群兩種測定方法的比較

陳海寧（廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉製重點實驗室， 廣州 510316）

摘　要】　  本文采用國家標準GB/T4789.3-2003大腸菌群測定和GB/T4789.32-2002大腸菌群的快速檢測中最可能數（MPN）的方法，檢測食品中的大腸菌群，結果顯示：381份樣品中兩種方法對大腸菌群的檢測結果相同，合格率均為86.6%，兩者符合率100％。
　　【關鍵詞】  　食品，大腸菌群，最可能數（MPN）

前言

　　大腸菌群並非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便汙染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方麵並非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞杆菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸杆菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸杆菌等。大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在於溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便汙染的地方，人、畜糞便對外界環境的汙染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。故以此作為糞便汙染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否汙染腸道致病菌的可能。如果大腸菌群存在於食品中，表明食品未做有效的消毒處理、加工後保存條件不良或消毒後又受到汙染。快速檢驗大腸菌群，有助於食品的衛生管理，維護消費者的健康安全。

　　國標GB/T4789.3-2003大腸菌群測定中乳糖膽鹽發酵法是常規三步法：乳糖膽鹽初發酵、伊紅美藍培養和乳糖複發酵、革蘭氏染色證實試驗。由於操作繁瑣，費時費力，不太能適應大量檢測工作的需求。因此尋找快捷、準確、標準化的大腸菌群測定方法，能夠省去了繁雜的試劑配製、分裝、消毒等工作，提高了工作效率，符合現代檢驗向快速、準確方向發展的要求。

1材料與方法

1.1 樣品

　　食糖、糖果、飲料、蜂蜜、餅幹、果凍、飲用水等7類食品共381份

1.2主要試劑及儀器

　　乳糖膽鹽發酵管、乳糖發酵管、伊紅美藍培養基、革蘭氏染色劑、MUGal肉湯、366nm紫外線燈。

1.3試驗方法

　　以無菌操作將檢樣25g放於含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內予置適當數量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液，用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。

1.3.1GB/T4789.3-2003中乳糖膽鹽發酵法

1.3.1.1發酵試驗

　　將待檢樣品稀釋液（液體飲料和飲用水用原液）接種於乳糖膽鹽發酵管內，前排三大管為雙料發酵管，內接種1：10的均勻稀釋液（液體飲料和飲用水原液）10mL，後排共六管，為單料發酵管，其中三管接種1：10的均勻稀釋（液體飲料和飲用水原液）1mL，另外三管接種1：100的稀釋液（液體飲料和飲用水1：10的均勻稀釋液）1mL，另取2支乳糖膽鹽發酵管（或雙料乳糖膽鹽發酵管），加入與樣品稀釋液等量的上述無菌生理鹽水作空白對照。將接種好的培養管置於36±1℃溫箱內，培養24±2h後，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產酸產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如果培養基變黃，產氣窗內有氣泡者，為產酸產氣，則進行證實試驗。

1.3.1.2證實試驗

　　將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內，培養18～24h，然後取出，觀察菌落形態，並做革蘭氏染色和證實試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置36±1℃培養箱內培養24±2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞杆菌，即可報告為大腸菌群陽性。根據大腸菌群陽性管數，查MPN表，報告每100ml（g)食品中大腸菌群MPN值。

1.3.2 GB/T4789.32-2002中MUGal肉湯法

　　將上述1.3.1.1接種培養液改為MUGal肉湯，其他步驟相同。另取2支MUGal肉湯管（或雙料MUGal肉湯管），加入與樣品稀釋液等量的上述無菌生理鹽水作空白對照。將接種後的培養管置於37±1℃溫箱內，培養18～24 h。將培養管置於暗處，用波長366nm紫外線燈照射，如顯藍色熒光，則為大腸菌群陽性管；如未顯藍色熒光，則大腸菌群陰性管。根據大腸菌群陽性管數，查MPN表，報告每100ml（g)食品中大腸菌群MPN值。

2結果與討論

2.1試驗結果如表1和表2所示。

采用國家標準GB/T4789.3-2003大腸菌群測定和GB/T4789.32-2002大腸菌群的快速檢測中最可能數（MPN）的方法，對食糖、糖果、飲料、蜂蜜、餅幹、果凍、飲用水等7種食品381份樣品進行大腸菌群檢測，結果顯示：檢驗合格的樣品均為330份，兩種方法對樣品檢驗的合格率相同，均為86.6%，兩者合格符合率100％；兩種方法對大腸菌群的檢測結果相符的有365份，符合率95.8％；不合格的51份樣品有16份的結果略有不同，占所有樣品的4.2%。

表1 食糖、糖果、蜂蜜、餅幹和果凍的乳糖膽鹽發酵法和MUGal肉湯法測定結果比較

表2 飲料和飲用水的乳糖膽鹽發酵法和MUGal肉湯法測定結果比較

表3乳糖膽鹽發酵法和MUGal肉湯法測定結果合格率比較

2.2  GB/T4789.3-2003大腸菌群測定中乳糖膽鹽發酵法是根據大腸菌群分解乳糖膽鹽中的乳糖，產酸產氣，並且使伊紅美藍培養基中伊紅與美藍結合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，在實際工作中，熟悉大腸菌群菌落特征色澤和形態，對檢出率影響很大。為了避免假陰性的判斷，通常需要多挑菌落，隻挑取一個菌落，由於機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現。判斷受影響的因素比較多，挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關係，所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現假陰性，因而造成工作量加大。對可疑菌落的選擇和判斷非常重要，因此這種檢驗方法對檢驗人員的操作經驗和熟練程度要求比較嚴格。　　

　　GB/T4789.32-2002大腸菌群的快速檢測中最可能數（MPN）的方法，是根據大腸菌群可產生β－半乳糖幹苷酶，分解液體培養基MUGal肉湯中的酶底物――4-甲基傘型酮－β－D－半乳糖苷(簡稱MUGal)，使4-甲基傘型酮遊離，因而在366nm的紫外線燈照射下呈現藍色熒光，能夠更直接得出結果，省去進一步的證實試驗，因此從培養到報到結果的時間可縮短為18～24 h，同時能夠避免假陰性的出現。

2.3  國標GB/T4789.3-2003大腸菌群測定乳糖膽鹽發酵法是常規三步法，由於操作繁瑣，費時費力，不太能適應大量檢測工作的需求。快速檢測能使原來的檢測周期由72小時縮短到18小時，同時大大簡化操作程序。MUGal肉湯試劑保存期限較長，操作方便，從培養到鑒定的時間相對縮短，有利於生產上的在線分析，及時了解食品指標的情況，發現問題能及時給予調整。MUGal肉湯法與常規的GB/T4789.3-2003大腸菌群測定乳糖膽鹽發酵法所采用的均為九管法，更有利於在結果上作比較。

2.4  大腸菌群的檢驗方法除了國家標準方法規定常規的乳糖膽鹽發酵法，快速檢測的MUGal肉湯法，還有一些其他方便快捷的方法，如采用平板顯色培養基，其結果隻能反映食品中的細菌狀況，但由於方法所得出的單位與國標有所不同，一般得出的直接結果是每克或每毫升的大腸菌群數，而現在大多數食品標準中，大腸菌群的指標是以九管法得出的最可能數（MPN）即個/100mL為單位，所以平板法難以與常規三步法難以作出直接比較，隻適宜食品生產企業在自主生產過程中的自主檢驗。

參考文獻
[1] GB/T4789-2003。中華人民共和國國家標準，食品衛生微生物學檢驗；
[2] （英）W.F.Harrigan著，李衛華等譯  食品微生物實驗室手冊（第三版）中國輕工業出版社 2004，111，115
[3]羅雪雲，劉宏道  食品衛生微生物檢驗標準手冊: ［M］.北京:中國標準出版社,1995:18～25

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