方法一
1、以5×10e5/ml的密度接種Hep-2細胞到6孔板中,每孔加入3ml細胞懸液;
2、待細胞長成單層後(不得超過48hr),移去營養液,每孔加入400ul的PBS和100ul毒液(10倍係列稀釋);
3、
4、棄去吸附液,每孔添加覆蓋層3ml,少於3ml細胞不易存活。覆蓋層以含5%小牛血清的2×DMEM和0.6%的瓊脂糖按1:1比例混合而成,這樣小牛血清的終濃度為2.5%,瓊脂糖為0.3%。瓊脂糖必須高壓滅菌,用前以微波爐充分融解,並放置
5、
6、剔除覆蓋層,用自來水輕柔的衝洗平板邊緣殘留的瓊脂糖;
7、每孔添加2-3ml的0.05%中性紅。貯存液為10×的,可保存數月之久,工作液以去離子水稀釋即可;
8、室溫染色1h-1d,吸掉染液,輕柔地清洗並打開蓋子令其幹燥後即可保存數年之久;
9、空斑計算方法同其它方法。
參考文獻:Jennifer L.McKimm-Breschkin,A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaques without immunostaining,J.Viro Methd.120(2004):113-117
方法二
1、以5×10e5/ml密度接種Hela細胞於12孔板中,每孔1ml,使之24h內能長成單層;
2、以2%DMEM(維持液)10倍係列稀釋好毒液;
3、吸去生長液,PBS洗滌細胞1-2次,每孔加入維持液500ul;
4、每孔加入稀釋好的毒液50ul,充分混勻,每個稀釋度做2個複孔,
5、微波爐充分融化無菌的3%瓊脂糖,65度水浴保溫備用,4%的2×DMEM預熱至
6、室溫或
7、取出板子,每孔加入100ul的MTT,
8、PFU計算方法同其它方法。
參考文獻:見重慶醫科大學兒童醫院免疫室
方法三
1、試驗前一天用2×105HEP22細胞接種24孔板。
2、以2倍的Eagle內加青鏈黴素、卡那黴素、碳酸氫鈉、瓊脂糖配成瓊脂覆蓋層;
3、倒出病毒液,加入瓊脂覆蓋層0.5ml ,冷凝後,倒置於
4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒樣品空斑形成單位,a指空斑均數,b指病毒稀釋度的倒數,v指病毒量);
參考文獻:鄒毅,黃海鷺,徐軍,鍾南山.小鼠的原發性呼吸道合胞病毒感染.中華結核和呼吸雜誌2001年8月第24卷第8期。
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