病毒RNA提取方法

1、取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照加入1.5ml滅菌eppendorf管；

2、加600ul異硫氰酸胍，然後加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻；

3、13000rpm離心15min；

4、在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul於-20℃預冷的異丙醇；

5、取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步準備的管中，顛倒混勻；

6、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清，在吸水紙上盡量沾幹液體；

7、加600ul75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇；

8、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清，在吸水紙上盡量沾幹液體；

9、4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸幹，室溫幹燥2－3min（不可過分幹燥，防止下一步RNA不溶解）；

10、加入20ulDEPE水(加入depc的純水高壓後的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時內使用，以免RNA降解）。

二、TRIzol LS提取法

所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的汙染。所用一切物品也應是無RNA酶。

1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS500ul，充分混勻，室溫放置10min；

2、加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現象），室溫放置10min（由於氯仿沸點低、易揮發，振蕩時離心管可能爆開，小心）；

3、4℃，13000r/min離心15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）；

4、加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min；

5、4℃，13000r/min離心15min，（這時乍一看會發現管子裏好像沒有東西，再仔細看看，會發現靠近管底的壁上有一星點的白色沉澱物，就是它了）用槍小心吸去所有上清；

6、1ml75%乙醇洗一遍，4℃，8000r/min離心10min，（這時又會發現管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超淨台中幹燥5min；

7、加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）；

8、建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇後凍存於－70℃，可保存一年；若加入DEPC水後則隻能在－20℃保存1個月左右。

三、Trizol法提取法（這是提禽流感病毒的步驟，供參考）

Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。

1、取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積Trizol液，混勻；

2、室溫放置5分鍾，然後以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；

3、取上層水相於一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鍾，12000g離心10分鍾；

4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鍾；

5、重複第4步；

6、小心棄去上清液，然後室溫幹燥5-10分鍾，注意不要幹燥過分，否則會降低RNA的溶解度；

7、然後將RNA溶於水中，放置10分鍾。

[注意]

1、整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作；

2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

上一篇：PEG沉澱法提純病毒

下一篇：輪狀病毒純化以及ELISA檢測