細菌群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定細胞數目的方法有顯微鏡直接計數法(direct microscopic count)、平板菌落計數法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質的方法有細胞幹重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產物的測定等。總之，測定微生物生長量的方法很多，各有優缺點，工作中應根據具體情況要求加以選擇。
本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法和光電比濁計數法。
一 顯微鏡直接計數法
（一）目的要求
1．明確血細胞計數板計數的原理。
2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。
（二） 基本原理
顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置於一種特別的具有確定麵積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，於顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用於酵母、細菌、黴菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。後兩種計菌器由於蓋上蓋玻片後，總容積為
用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特製的載玻片，其上由四條槽構成三個平台；中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各列有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的麵積為lmm2，蓋上蓋玻片後，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)
計數時，通常數五個中方格的總菌數，然後求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然後再換算成lmL菌液中的總菌數。
設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數板，則
1mL菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=
同理，如果是16個中方格的計數板，則
1mL菌液中的總菌數=A/5×16×104×B=
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母
2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。
（四）操作步驟
l．菌懸液製備
以無菌生理鹽水將釀酒酵母製成濃度適當的菌懸液。
2．鏡檢計數室
在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有汙物，則需清洗，吹幹後才能進行計數。
3．加樣品
將清潔幹燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。
取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。
4．顯微鏡計數
加樣後靜止5min，然後將血細胞計數板置於顯微鏡載物台上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。
調節顯微鏡光線的強弱適當，對於用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線，或隻見豎線或隻見橫線。
在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度後再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位於格線上的菌體一般隻數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。
5．清洗血細胞計數板
使用完畢後，將血細胞計數板在水龍頭用水衝洗幹淨，切勿用硬物洗刷，洗完後自行晾幹或用吹風機吹幹。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不幹淨，則必須重複洗滌至幹淨為止。
二 平板菌落計數法
（一）目的要求
學習平板菌落計數的基本原理和方法。
（二）基本原理
平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之後，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由於待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。
平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由於該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用於生物製品檢驗(如活菌製劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或汙染程度的檢測。
（三）器材
1．菌種 大腸杆菌菌懸液。
2．培養基 牛肉膏蛋白陳培養基。
3．儀器或其他用具1mL無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。
（四）操作步驟
l．編號
取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀釋
用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸杆菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5mL至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多餘的菌液放回原菌液中。
將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10 1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液麵，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。其餘依次類推。
放菌液時吸管尖不要碰到液麵，即每一支吸管隻能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。
3．取樣
用三支1mL無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。不要用lmL吸管每次隻靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重複平板間的操作誤差。
4．倒平板
盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化後冷卻至
由於細菌易吸附到玻璃器皿表麵，所以菌液加入到培養皿後，應盡快倒入融化並於已冷卻至
待培養基凝固後，將平板倒置於
5．計數
培養48h後，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，並按下列公式進行計算，
每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重複的平均菌落數×稀釋倍數×5
一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重複對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重複對照平板不能少於三個，這樣便於數據統計，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。
平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養後所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。
平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用塗布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是後者先將牛肉膏蛋白腖培養基融化後倒平板，待凝固後編號，並於
塗布平板用的菌懸液量一般以0.1mL較為適宜，如果過少菌液不易塗布開，過多則在塗布完後或在培養時菌液仍會在平板表麵流動，不易形成單菌落。
三 光電比濁計數法
（一）目的要求
1．了解光電比濁計數法的原理。
2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。
（二）基本原理
當光線通過微生物菌懸液時，由於菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的範圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出。因此，可用一係列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線。然後，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。製作標準曲線時，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞幹重測定等方法。本實驗采用血細胞計數板計數。
光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合於自動控製。但是，由於光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對於不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件製作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對於顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他幹擾物質的懸液不適合用此法進行測定。
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母培養液
2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。
（四）操作步驟
1．標準曲線製作
（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。
（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養24小時的釀酒酵母菌懸液，並用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。
（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻後於560nm波長、
（4）以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪製標準曲線。
2．樣品測定
將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻後，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。
各種操作條件必須與製作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。
3．根據所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數。
每毫升樣品原液菌數=從標準曲線查得每毫升的菌數×稀釋倍數
polly110是這樣做的，搖菌8-12h，然後對菌液十倍稀釋進行平板計數法，得出每毫升的含菌量，再對菌液進行稀釋，得到你所要求的10的9次方/CFU的懸液。
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