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細菌的兩種鞭毛染色法



錄入時間:2010-10-29 10:57:47 來源:生命經緯知識庫

(一)實驗目的:學習細菌的鞭毛染色法

(二)實驗原理:細菌的鞭毛極細,直徑一般為10—20nm,隻有用電子顯微鏡才能觀察到。但是,如采用特殊的染色法,則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然後再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配製而成。現推薦以下兩種染色法。

(三)實驗器材

1.活材料:培養12-16h的水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae),粘質賽氏杆菌(Serratia marcescens)或假單細胞菌(Pseudomonas sp.)斜麵菌種。

2.染色液和試劑:硝酸銀染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。

3.器材:載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環,顯微鏡。

(四)實驗方法

1.鍍銀法染色

1)清洗玻片  選擇光滑無裂痕的玻片,最好選用新的。為了避免玻片相互重疊,應將玻片插在專用金屬架上,然後將玻片置洗衣粉過濾液中(洗衣粉煮沸後用濾紙過濾,以除去粗顆粒),煮沸20min。取出稍冷後用自來水衝洗、晾幹,再放入濃洗液中浸泡5—6天,使用前取出玻片,用自來水衝去殘酸,再用蒸餾水洗。將水瀝幹後,放入95%乙醇中脫水。

2)菌液的製備及製片:菌齡較老的細菌容易失落鞭毛,所以在染色前應將待染細菌在新配製的牛肉膏蛋白腖培養基斜麵上(培養基表麵濕潤,斜麵基部含有冷凝水)連續移接3-5代,以增強細菌的運動力。最後一代菌種放恒溫箱中培養12—16h。然後,用接種環挑取斜麵與冷凝水交接處的菌液數環,移至盛有1—2mL無菌水的試管中,使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37恒溫箱中靜置10min(放置時間不宜太長,否則鞭毛會脫落),讓幼齡菌的鞭毛鬆展開。然後,吸取少量菌液滴在潔淨玻片的一端,立即將玻片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多餘的菌液。塗片放空氣中自然幹燥。

用於鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化後倒入無菌平皿中,待凝固後在平板中央點接活化了3-4代的細菌,恒溫培養12-16h後,取擴散菌落的邊緣製作塗片。

3)染色

滴加A液,染4—6min

用蒸餾水充分洗淨A液。

B液衝去殘水,再加B液於玻片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5—1min(加熱時應隨時補充蒸發掉的染料,不可使玻片出現幹涸區)。

用蒸餾水洗,自然幹燥。

4)鏡檢:先低倍,再高倍,最後用油鏡檢查。

結果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色。

2.改良Leifson染色法

1)清洗玻片法同1

2)配製染料  染料配好後要過濾15-20次後染色效果才好。

3)菌液的製備及塗片

菌液的製備同1

用記號筆在潔淨的玻片上劃分3—4個相等的區域。

1滴菌液於第一個小區的一端,將玻片傾斜,讓菌液流向另一端,並用濾紙吸去多餘的菌液。

幹燥  在空氣中自然幹燥。

4)染色

加染色液於第一區,使染料覆蓋塗片。隔數分鍾後再將染料加入第二區,依此類推(相隔時間可自行決定),其目的是確定最合適的染色時間,而且節約材料。

水洗:在沒有傾去染料的情況下,就用蒸餾水輕輕地衝去染料,否則會增加背景的沉澱。

幹燥:自然幹燥。

5)鏡檢  先低倍觀察,再高倍觀察,最後再用油鏡觀察,觀察時要多找一些視野,不要企圖在1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。

結果:菌體和鞭毛均染成紅色。

(五)實驗作業:給出鞭毛菌的形態圖

(六)注意事項

1.鍍銀法染色比較容易掌握,但染色液必須每次現配現用,不能存放,比較麻煩。

2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響,且染色液須經15-20次過濾,要掌握好染色條件必須經過一些摸索。

3.細菌鞭毛極細,很易脫落,在整個操作過程中,必須仔細小心,以防鞭毛脫落。

4.染色用玻片幹淨無油汙是鞭毛染色成功的先決條件。

附:細菌的運動性觀察

(一)實驗原理  細菌是否具有鞭毛是細菌分類鑒定的重要特征之一。采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態、著生位置和數目,但此法既費時又麻煩。如果僅須了解某菌是否有鞭毛,可采用懸滴法或水封片法(即壓滴法)直接在光學顯微鏡下檢查活細菌是否具有運動能力,以此來判斷細菌是否有鞭毛。此法較快速、簡便。

懸滴法就是將菌液滴加在潔淨的蓋玻片中央,在其周邊塗上凡士林,然後將它倒蓋在有凹槽的載玻片中央,即可放置在普通光學顯微鏡下觀察。水封片法是將菌液滴在普通的載玻片上,然後蓋上蓋玻片,置顯微鏡下觀察。

大多數球菌不生鞭毛,杆菌中有的有鞭毛有的無鞭毛,弧菌和螺菌幾乎都有鞭毛。有鞭毛的細菌在幼齡時具有較強的運動力,衰老的細胞鞭毛易脫落,故觀察時宜選用幼齡菌體。

(二)實驗器材

1.活材料:培養12-16h小時的枯草杆菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)。

2.試劑:香柏油、二甲苯、凡士林等。

3.器材:凹載玻片、蓋玻片、鑷子、接種環、滴管、擦鏡紙、顯微鏡。

(三)實驗方法:

1.製備菌液:在幼齡菌斜麵上,滴加3-4mL無菌水,製成輕度混濁的菌懸液。

2.塗凡士林:取潔淨無油的蓋玻片1塊,在其四周塗少量的凡士林。

3.滴加菌液:加1滴菌液於蓋玻片的中央,並用記號筆在菌液的邊緣做一記號,以便在顯微鏡觀察時,易於尋找菌液的位置。

4.蓋凹玻片  將凹玻片的凹槽對準蓋玻片中央的菌液,並輕輕地蓋在蓋玻片上,使兩者粘在一起,然後翻轉凹玻片,使菌液正好懸在凹槽的中央,再用鉛筆或火柴棒輕壓蓋玻片,使玻片四周邊緣閉合,以防菌液幹燥。

若製水封片,在載玻片上滴加一滴菌液,蓋上蓋玻片後即可置顯微鏡下觀察。

5.鏡檢  先用低倍鏡找到標記,再稍微移動凹玻片即可找到菌滴的邊緣,然後將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。由於菌體是透明的,鏡檢時可適當縮小光圈或降低聚光器以增大反差,便於觀察。鏡檢時要仔細辨別是細菌的運動還是分子運動(即布朗運動),前者在視野下可見細菌自一處遊動至他處,而後者僅在原處左右擺動。細菌的運動速度依菌種不同而異,應仔細觀察。

結果:有鞭毛的枯草杆菌和假單胞菌可看到活躍的運動,而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不運動。

(四)實驗作業:繪出所看到的細菌的形態圖,並用箭頭表示其運動方向。

(五)注意事項

1.檢查細菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔淨無油,否則將影響細菌的運動。

2.製水封片時菌液不可加得太多,過多的菌液會在蓋玻片下流動,因而在視野內隻見大量的細菌朝一個方向運動,從而影響了對細菌正常運動的觀察。

3.若使用油鏡觀察,應在蓋玻片上加香柏油一滴。

編者注:由於二甲苯對身體有害,可用無水乙醇:無水乙醚=2837代替,乙醚由麻醉作用,對身體亦有害,隻是相對更好,且可以更好地保護鏡頭。

 

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