大腸杆菌 O157:H7的檢驗

大腸杆菌 O157:H7的檢驗
    1、培養基製備：
    改良EC新生黴素增菌肉湯 （mEC）： EC肉湯滅菌後添加20mg/mL過濾除菌的新生黴素，使終濃度為20μg/mL。
    改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）：山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克汙，使終濃度為0.05mg/L。
    MUG-LST肉湯：LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。
    2、增菌培養
    秤取25克樣品放入225mL mEC中，均質。於41±1℃培養18-24小時。
    3、分離
    將mEC肉湯培養物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL塗布於TC-SMAC平板。於36±1℃培養18~24小時。
    可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。
    4、鑒定
    挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，於36±1℃培養18~24小時，出現產氣，且無熒光者，分離到普通營養瓊脂。
    對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗，必要時進行生化試驗。
    在檢測過程中，也可以在選擇性增菌後，取出5mL增菌液，經100℃水浴15分鍾滅活後，供自動酶聯熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結果，陽性反應者需作進一步證實。
    EHEC O157:H7檢驗程序圖解
    檢樣25g
    ↓
    mEC225mL → VIDAS快速篩選
    ↓41±1℃，18-24h
    10-4，10-5，10-6稀釋度塗布TC-SMAC
    ↓36±1℃，18-24h
    挑取5-10個可疑菌落接種MUG-LST
    ↓36±1℃，18-24h
    MUG陰性培養物轉種普通營養瓊脂
    ↓     ↓
    生化反應鑒定    血清凝集鑒定
    或
    膠乳凝集試驗
    用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽性者，報告檢出腸出血性大腸杆菌O157:H7。
    如需要進一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過接種Vero細胞或Hela細胞，觀察細胞病變進行判定，或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應（PCR）檢測法。（參見FDA細菌分析手冊第8版）

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