自製兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基檢測食品中金黃色葡萄球菌的效果觀察

  自製兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基檢測食品中金黃色葡萄球菌的效果觀察 

趙貴明  劉沛  邊淩淳  張旭 ( 中國進出口商品檢驗技術研究所，北京100025 )   

摘  要：為提高食品中金黃色葡萄球菌的檢測效率，用自製兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基( RPF瓊脂培養基，在Baird-Parker瓊脂培養基中添加兔血漿纖維蛋白原)與Baird—Parker瓊脂檢測了25份從市場上挑選的食品，部分樣品人工添加 了金黃色葡萄球菌，比較了二者的檢測結果。在定性試驗中，添加了金黃色葡萄球菌的1～15號樣品，二者均為陽性結果，在10份自然樣品中兔血漿纖維蛋白原瓊脂檢出3例，Baird—Park瓊脂檢出2例，定量試驗結果表明，二者相關係數為r =0.98，使用RPF瓊脂可以節省2／3檢測時間。基於兔血漿纖維蛋白原瓊脂技術的準確性和高效率，建議推廣使用 。 

金黃色葡萄球菌是食品微生物常規檢驗項目。檢測金黃色葡萄球菌的培養基有十多種，其中Baird—Parker培養基是應用較廣泛的培養基，我國食品微生物檢驗標準和出口食品微生物檢驗行業標準就使用該種培養基，但該培養基在發現可疑菌落後還需要用肉湯培養基增菌後進行凝固酶確證實驗，共需要6d時間，目前已有金黃色葡萄球菌的多種快速檢測方法。1999年國際標準化組織頒布了應用瓊脂技術檢測食品和動物飼料中凝固酶陽性葡萄球菌計數方法，我們參照ISO6888研製了兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基( RPF瓊脂培養基，在Baird-Parker瓊脂培養基中添加兔血漿纖維蛋白原)，並用製備的RPF瓊脂和Baird—Parker培養基檢測了25份食物樣品，並進行了比較，部分樣品還與卵黃甘露醇高鹽瓊脂檢測結果進行了比較，結果報告如下 。 

1 材料和方法

1.1   試驗菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)26112、189，26113，其中26112、189菌株血漿凝固酶為陽性，26113菌株血漿凝固酶為陰性，均購自中國藥品生物製品檢定所。試驗菌株均於胰酪腖大豆肉湯中35℃培養24 h，比濁法計數約10⁸CFU／ml，用滅菌磷酸鹽緩衝液( PBS)進行10倍稀釋至10^-3。 

1.2 試劑  Baird—Parker培養基基礎，凍幹卵黃，高鹽甘露醇瓊脂基礎，胰酶抑製劑，sigma；亞碲酸鉀，北京市中聯特化工有限公司 。 

1.2.1   RPF瓊脂增補劑製備   牛纖維蛋白原無菌采集新鮮牛血，加入抗凝劑 ( 4％枸櫞酸鈉溶液與血液比例為1：9)，4℃2500 r／min離心10 min，去除血球，收集血漿，用0.01 N HC1或0.01 N  NaOH調整pH值至7.2，預冷至-3℃(用氯化鈣、碎冰塊調節溫度)，在該溫度下冷乙醇至8％，邊滴加邊攪拌，靜置10 min，4℃5000 r／min離心15min，收集沉澱，加入生理鹽水和適量的穩定劑(每克蛋白質用0.16 mmol辛酸鈉)，分裝，凍幹，以上程序可參照《凍幹人纖維蛋白原製造及檢定規程》和《人血白蛋白(低溫乙醇法) 製造及檢定規程》。兔血漿製備心髒采血，參照SN 0172—1992標準。

1.2.2 培養基製備 Baird—Parker 培養基、卵黃甘露醇高鹽瓊脂配製按廠家說明書使用。RPF瓊脂配製在符合GB4789．28中4.6規定的Baird-Parker基礎上，加入規定量90％的蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓15 min，晾至50℃時，每100 ml Baird—Parker基礎添加10ml  RPF增補劑(增補劑含纖維蛋白原0.5g、兔血漿 5ml、亞碲酸鉀2.5mg，胰酶抑製劑2.5mg，用10％體積培養基的無菌水溶解)，輕輕搖勻，傾注直徑90mm平皿，每塊約15 ml，室溫凝固後備用，培養基為淺黃色半透明固體。 

1.3 試驗樣品  按照各國要求檢驗金黃色葡萄球菌項目的食品種類隨機從超市 購買，其中生肉類7份，肉類製品5份，豆製品3份，水產品3份，調味品2份，乳製品1份，其它食品4份(包括罐頭、薯片、冷凍飯團、玉米羹)，共25份。稱取25g固體試樣(液體試樣吸取25ml )，加入225ml滅菌生理鹽水均質，製成混懸液，參照GB 4789．10—1994。在1～5號試樣中各添加10^-2培養物稀釋 液0.1ml，6～10號試樣中各添加10^-3培養物稀釋液0.1 ml，11～15號試樣各添加 10^-4培養物稀釋液0.1 ml，混合均勻，16～25號試樣為自然樣品。

1.4 定性實驗  吸取1:10試樣混懸液5ml，接種於50ml胰酪腖大豆肉湯中，36℃培養24h，分別劃線接種於RPF瓊脂、Baird-Parker瓊脂平板，部分試樣接種了卵黃甘露醇高鹽瓊脂，於36℃培養24～48h，觀察結果，在RPF瓊脂上呈黑色菌落，帶有3mm大小的纖維蛋白沉澱圈的菌落為金黃色葡萄球菌典型菌落。對Baird —Parker 瓊脂平板和卵黃甘露醇高鹽瓊脂上生長的典型菌落則按國標方法進一步通過血漿凝固酶試驗確證，每份試樣統計陰性和陽性結果。

 1.5 定量實驗  吸取1 m  1:10試樣稀釋液滴加於3塊RPF瓊脂、Baird—Parker瓊脂平板，部分試樣接種了卵黃甘露醇高鹽瓊脂平板，用L棒塗布均勻，於36℃培養24～48 h，在RPF瓊脂上統計黑色並帶有3mm大小的纖維蛋白沉澱圈的金黃色葡萄球菌典型菌落，Baird-Parker瓊脂平板和卵黃甘露醇高鹽瓊脂平板上典型菌落再進行確證實驗，計數，為便於比較，將結果換算成以10為底的對數單位。 

2   結 果

2.1 定性實驗  在25份樣品中，RPF瓊脂培養基共檢出18例陽性，Baird-Parker 瓊脂檢出17例，卵黃甘露醇高鹽瓊脂檢測結果基本一致，其中添加了金黃色葡萄球菌的1～1 5號樣品，RPF瓊脂和Baird-Park瓊脂均為陽性結果，在10份自然試樣中RPF瓊脂檢出3例，樣品編號21、23、25，Baird-Park瓊脂檢出2例 ， 樣品編號21、23 (結果見表1 )。

表1 定性實驗結果

注：“+”為陽性，“-”為陰性，“/”為未進行試驗。RPFagar 為兔血漿纖維蛋白原瓊脂；MSEY為卵黃甘露醇高鹽瓊脂

2.2 定量實驗  在15份添加了金黃色葡萄球菌樣品中，1～5號樣品含150～250CFU／ml，6～1 0號樣品含1 0～50 CFU／ml ，11～15號樣品含1～10CFU ／m l。RPF瓊脂和Baird-Parker瓊脂檢測結果一致， 具有很好的相關性，但也有區別，在對數值2以下(菌落數100 CFU／g )，RPF瓊脂生長的菌落數多於Baird—Parker 培養基，分析結果見表2。卵黃甘露醇高鹽瓊脂檢測結果與二者差異無明顯性 。 

表 2   RPF瓊脂和Baird—Parker 培養基檢測結果區別

3 討 論

3.1   Baird-Parker是檢測食品中金黃色葡萄球菌最常用的培養基，其優點表現在對食品加工過程中受到損傷的金黃色葡萄球菌具有較高的回收率，但不能檢測 出對卵黃反應陰性的金黃色葡萄球菌，典型菌落需要進一步增菌後用凝固酶實驗 確證，多花費2d時間。

3.2 金黃色葡萄球菌在自製的RPF瓊脂生長後，還原亞碲酸鉀呈黑色菌落，通過凝固酶的作用，水溶性纖維蛋白原成為不溶性纖維蛋白，在菌落周圍形成沉澱， 出現3mm大小的白色圈，菌落特征明顯，無論定性和定量檢測實驗，自製的RPF瓊脂與Baird-Parker具有很好的一致性和相關性，說明自製的兔血漿纖維蛋白原增補劑達到了實驗要求。實驗中金黃色葡萄球菌產生的白色沉澱圈大小不均一，這主要取決於細菌產生凝固酶的強弱，本實驗中金黃色葡萄球菌菌株26112沉澱圈大於189 ，而26113則無沉澱圈，結果與試管凝集法的結果一致(分別為4個加號、2個加號和不凝集) 。

3.3 在特異性方麵，本文雖未進行試驗，但據文獻報道，RPF瓊脂檢測金黃色葡萄球菌的假陽性率僅為1％，主要來自中間葡萄球菌，自然界中中間葡萄球菌僅占葡萄球菌屬的1％；假陰性率為2％，主要是金黃色葡萄球菌並非100％都產生凝固酶，而且強弱不同。

3.4 利用RPF瓊脂技術檢測肉及肉製品、豆製品、水產品等食品中金黃色葡萄球菌，直接計數法和定性檢測分別在24h和48h內得出結果，基於其準確性和高效率(節省三分之二時間)，應盡快推廣應用。 

參考文獻 (略)： 

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