重組大腸杆菌DH5α發酵培養基的優化

  重組大腸杆菌DH5α發酵培養基的優化

張怡潔，李聰，王鵬，申燁華，張英起

摘要：為了提高重組大腸杆菌DH5α生產rNGR—Tum一5，研究了培養基中不同種類的碳氮源物質和微量元素對工程菌生產蛋白能力的影響。得出在培養基組分(％)為：甘油1，酵母粉3，蛋白腖1，氯化鈉0.5，微量元素母液150μm時，重組大腸杆菌DH5α生產rNGR- Tum一5最強，較初始培養基提高了5倍。 

Tumstatin(膠原IVα3 鏈的非膠原區域1 )是一種內源性血管生長抑製因子。Turn一5是由Tumstatin接近N端的54—132位氨基酸組成的，它是Tumstatin抗血管形成的功能結構域，含有5個半胱氨基酸，與全長的Tumstatin具有同等的抗血管生成效能，但可降低其引起肺一腎出血綜合症的副作用。NGR是從噬菌體展示文庫中篩選出的一種可以和腫瘤新生血管特異性結合，含13個氨基酸的寡肽。目前，基於NGR導向肽所建立的以腫瘤血管為靶位的治療策略已經廣為應用。rNGR—Turn -5是一種抗腫瘤血管生成的基因工程藥物， 既具有腫瘤血管導向性，又是內源性腫瘤血管生成抑製劑的衍生物。本研究對培養基的主要成分—碳、氮源進行了優選，並考察了微量元素對菌體生長和蛋白表達的影響，以期提高rNGR—Turn一5的產量，為其工業化生產提供依據。 

1 材料與方法

1.1 菌種

E．coli DH5α／pQE—TN(rNGR—Turn一5 )工程菌由第四軍醫大學生物技術中心構建。

1.2 培養基

常用培養基LB、M9、SOB、MBL。 

微量元素母液的配製：每1L溶液中含有：FeCl3·6 H2O  3.24g，ZnCl2  0.22 g，CoC12·6H2O  0.24 g，NaMoO4·2H2O 0.24g，CaC12·2H2O  0.12g，CuSO4·5H2O  0.20g，H3BO3  1.0g， MgSO4  0.74g 。

1.3 試劑

酵母粉、蛋白腖係英國Oxoid產品，蔗糖、葡萄糖、甘油、N H4C1、N aCl等均係國產分析純試劑。 

1.4 培養方法

-70℃甘油管凍存之工程菌劃線接種於含氨苄 (Amp )的LB固體瓊脂平板中，37℃孵箱放置 12h，挑取單克隆接種於裝有5mL指定培養基的小試管中，在30℃，200 rpm的搖床上活化振蕩過夜。8h 後取2m L菌液以1：100比例接種於裝有200m L指定培養基(含100g／mLA mp)的搖瓶中，37℃進行培養。進入對數期中期後，加入IPTG( 0. 5mmol／L)誘導，4h後4200  rpm離心20 min，收菌。 

1.5 菌體濃度的測定

比色法測定，以600nm波長處的光密度 OD600表示。

1.6 蛋白rNGR—Tum一5表達量的測定

發酵液菌體做SDS — PAGE，用Band—scan軟件測定rNGR—Turn一5表達量。 

2 結果與討論

2.1 不同培養基對菌種生長及蛋白表達量的影響

提取菌種質粒，並轉化至感受態細胞，在LB瓊脂培養基上劃板，挑選出表達量高的單克隆做為菌種以供後續實驗使用。分別用培養基LB、M9、SOB、MBL在同一條件下培養菌種， 分別考查不同培養基對重組大腸杆菌DH5α的生長量和目標蛋白一GR—Tum一5表達量的影響，實驗結果見表1。由表1可見，工程菌在LB培養基中生產rNGR—Tum一5的能力最大，為0.54。所以選定LB培養基進行優化實驗。

表1 四種培養基中蛋白生產能力

2 _ 2 培養基中碳源的優化

工程菌多采用甘油、葡萄糖、蔗糖做為碳源，因此分別添加不同濃度的甘油、葡萄糖、蔗糖與不含碳源的初始LB培養基作對照，考查不同種類、不同濃度的碳源物質對重組大腸杆菌DH5α的生長量和rNGR—Turn一5 表達量的影響情況，實驗結果可知添加甘油和葡萄糖後，終止OD由4.5最高可增長到6.9 (葡萄糖或甘油1％處)，高於不加碳源時的水平； 而添加蔗糖時，對終止OD600影響程度較小，由4.5最高可增長到5.9；隨著碳源濃度的增高，終止OD都是先升高後降低，有一個最優值。這可能是因為碳源濃度過高時，糖代謝產生過量的酸性物質，使菌體生長的微環境惡化，影響某些酶的活性，抑製了菌體的生長。

培養基添加碳源後，rNGR—Tum一5的表達都有不同程度的提高。其中甘油的添加影響效果最明顯，使目標蛋白碳源對rNGR—Tum一5表達量的影響的表達量由12％提高到28％，添加葡萄糖，蔗糖使目標蛋白的表達量由12％分別提高到22％和20％。並且隨著碳源濃度的增加，目標蛋白的表達同樣經曆了一個先升後降的過程。

以碳源濃度為橫坐標，rNGR—Tum一 5的生產能力為縱坐標，可看出甘油濃度在1％時，工程菌生產NGR—Tum一 5的能力最強，所以選定1％的甘油為碳源物質。碳源對工程菌生產rNGR—Tu m一5能力的影響

2.3 培養基中氦源的優化

原LB培養基中含有2種氮源(酵母粉和蛋白腖)，蛋白腖含量保持不變(1％)，酵母粉的添加量發生變化；酵母粉含量保持不變( 0.5％)，蛋白腖的添加量發生變化；酵母粉(0.5％)和蛋白腖(1％) 含量都不變，氯化銨的添加量發生變化。選擇1％ 的甘油為碳源物質，氯化鈉含量保持不變，考察不同種類、不同濃度的氮源物質對菌種生長和rNGR—Tum一5表達情況的影響。 

可知，與含有單一氮源物質相比，增加有機氮源酵母粉和蛋白腖能有效促進菌體的生長，酵母粉的添加使終止OD 從 3.5 提高到8.1，蛋白腖的添加使終止OD從3.8提高到 7.8。在複合氮源(酵母粉0.5％，蛋白腖1％) 的基礎上，添加無機氮源氯化銨的影響甚微，使終止OD從6.9提高到7.3。與碳源的添加類似，隨著氮源濃度的升高，終止OD有一個先升後降的趨勢。氮源物質的添加能不同程度提高蛋白的表達量。其中酵母粉的添加能使蛋白的最高表達量從 12％提高到38％，而蛋白腖和氯化銨的添加分別使蛋白的最高表達量從10和28％提高到35％和37％。並且隨著氮源濃度的增大，目標蛋白的表達仍經曆了一個先增後減的過程，可能是因為氮源過多時，氨基酸的代謝產物對菌體生長和目標蛋白的表達有抑製作用引 。

 以氮源濃度橫坐標，rNGR—Tum一5的生產能力為縱坐標，在酵母粉濃度為3％，蛋白腖濃度為1％時，目標蛋白生產能力最強，可達3.4。所以選定氮源成分為 3％ 的酵母粉和1％的蛋白腖。 

2.4 培養基中微量元素的優化

微生物在生長繁殖過程中，需要某些無機鹽如磷，鎂，硫，鉀，鈉等，以作為其生理活性物質的組成或生理活性作用的調節物。這些物質一般在低濃度時對微生物生長和產物合成有促進作用，在高濃度時常表現出明顯的抑製作用。而各種不同微生物及同種微生物在不同的生長階段對這些物質的最適濃度要求均不相同，因此在生產中要通過實驗預先了解菌種對微量元素的最適需求量，以穩定或提高產量。

在100m L選定的培養基中分別添加0，50，100，150，200μl 微量元素母液，培養基用空白，A，B，C，D表示。實驗結果見表2 。 由表2可見，添加微量元素後，終止OD和目標蛋白的表達略有提高，其中添加微量元素母液150 μL時，終止OD最大，為表2微量元素對工程菌生長情況及蛋白表達的影響8.4，同時rNGR—Tum 一5 表達量也最大， 為42％。 

表2 微量元素對工程菌生長情況及蛋白表達的影響

2.5優化培養基實驗

優化後的培養基記為LB1，組成成分是甘油1％、酵母粉3％、蛋白腖1％、氯化鈉0.5 ％。LB1與LB培養基的實驗結果見表3。為 rNGR—Turn一5在兩種培養基中表達量的對比。

由表3可，與初始LB培養基相比，優化後培養基LB1使菌體終止OD600由4.5提高到8.4，rNGR—Tum一5表達量由12％提高到42％，目標蛋白的生產能力也隨著大幅增長，由0.54增長到3.5，較初始提高了5倍，為工程菌的高密度發酵奠定基礎。 

表3

參考文獻（略）

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