中生菌素產生菌發酵合成培養基的設計優化

  中生菌素產生菌發酵合成培養基的設計優化

田雲龍 蔣細良。姬軍紅 朱昌雄  

摘要 ：目的  針對目前沒有適合中生菌素產生菌的合成培養基的現狀，進行中生菌素產生菌發酵合成培養基的設計，並對其進行優化，以期為以後中生菌素產生菌發酵生產、營養生長、代謝、遺傳育種和產素機製的研究提供基礎。方法  順序通過無機氮源和有機氮源的篩選、正交試驗，並利用統計學軟件SPSS V13.0對實驗數據進行分析，確定並優化中生菌素產生菌發酵合成培養基的組成成分。結果  最終確定了中生菌素產生菌發酵合成培養基，該培養基在定量加入微量元素的基礎上，組成成分為穀氨酸鈉0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性澱粉1.5％，NH₄C1 0.3％，KH₂PO₄  0.02％，MgSO₄0.025％，NaC10.5％，CaCO₃ 0.3％。結論  經過發酵驗證，該培養基的產素能力可達2000μg／mL左右，雖然比天然成分培養基低，但可以滿足以後營養生長、代謝、遺傳育種和產素機製等的研究。 

關鍵詞：   中生菌素；合成培養基；設計；優化

中生菌素是新型的農用抗生素，它對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌都有強烈的抑製或殺傷作用，對水稻白葉枯病、白菜軟腐病、蘋果輪紋病及蘋果葉斑病等有良好的防效。目前，中生菌素已在全國部分省市應用推廣，並取得了較大的經濟效益。 

一直以來，中生菌素研究及發酵生產所用的培養基均為天然培養基(其中含有豆餅粉、玉米粉)，該類培養基的成分複雜，碳源和氮源豐富，使用這種富營養型培養基進行發酵，效價較高，目前搖瓶效價可達5000μg／mL。但由於其中的豆餅粉和玉米粉成分複雜，不同產地、不同批次存在差異，影響了對實驗結果進行定量和定性分析，合成培養基則可以彌補這個缺點。通過對合成培養組分的研究，確定影響發酵的主要因子，有利於優化發酵培養基，推動實際生產，也利於對發酵代謝機製的研究。

以不同的化學成分已知的氮源代替原培養基中的天然氮源，進行中生菌素合成培養基成分的篩選優化，比較發酵結果，選定合成培養基中所要采用的合成氮源；然後進行正交實驗，利用統計學軟件SPSS Version 13.0對實驗數據進行分析，最終確定了中生菌素產生菌的合成培養基的組成成分，為以後研究中生菌素產素菌營養生長、代謝、遺傳育種和產素機製提供了有力工具。

1   材料與方法

1.1 菌種

發酵所用菌種為淡紫灰鏈黴菌海南變種(Streptomyces  lavendulae var．hainanensisn ) UV -69突變株，由中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所保存。 

1.2 培養基

澱粉培養基：可溶性澱粉10g、KH₂PO₄  1g、MgSO₄   0.5 g、NaNO₃  2g、KC1  0.5g，FeSO₄   0.01g，瓊脂l5.20g，用1000mL開水順序加入，自然pH值。 

微量元素：每1000mL合成培養基中加入0.017mg(NH₄) ₆Mo₇O₂₄•4 H₂O，0.026mg   H₃BO₃， 0.18mg CuSO₄•7H₂O， 4mg ZnSO₄•7H₂O，1mg FeSO₄， 10 mg MnCl₂•4H₂O 。 

1.3 培養方法

斜麵菌種的培養：用接種環從保存的斜麵菌種中刮取淡紫灰鏈黴菌海南變種的孢子，轉接到新鮮的澱粉斜麵培養基中，培養箱中，28℃培養5—7d。

茄子瓶種子的培養：用接種環從試管斜麵菌種中刮取菌種，轉接到新鮮的茄子瓶澱粉培養基中，培養箱中，28℃培養5-7d 。 

搖瓶發酵：從培養好的茄子瓶菌種斜麵中挖取小菌塊轉移到搖瓶中，然後在200r／min，29℃條件下培養64h 。 

1.4 效價測定

采用管碟法測定生物效價，以枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)作為指示菌。 

1.5 合成培養基的篩選優化方法

采用正交實驗法對合成培養基的組成進行優化。試驗采用L27 (3¹³) 正交表，表頭設計及因素水平設置見表1和表2 。整個試驗共27個處理，每個處理設置2個重複。 

表1 正交實驗表頭設計

Tab．1   Design  of   orthogonal  test  by  L27 (3¹³ ) matrix

表2 正交實驗因素及水平

Ta b．2   Factors  and  levels  assigned  in  the  L27 (3¹³ )orthogonal  matrix 

1.6 數據的統計處理

使用SPSS13.0軟件對實驗數據進行統計分析。 

2 結果與分析

2.1 合成培養基中氮源的篩選

選取穀氨酸鈉、脲、NH₄Cl作為氮源，再加以不同組合，各設置4次重複分別進行發酵，結果見表3。 從表3可以看出，穀氨酸鈉與NH₄C1 組合作為氮源發酵效價較高，分別比其它幾種氮源高38.78％，30.77％，54.55％，67.49％，9.67％，因此選定其作為合成培養基的氮源。

 表3 氮源篩選實驗結果

表4 正交試驗結果

2.2 合成培養基的篩選

利用正交實驗方法5 種主要營養成分穀氨酸鈉(A)、葡萄糖(B)、澱粉(C)、NH₄Cl (D)、KH₂PO₄ (E) 進行優化，實驗結果見表4。 

利用SPSS  Version  13.0 統計軟件對正交試驗結果進行方差分析和多重比較。分析結果見表5 和表6 。

表5 方差分析表

R²=0.896(調整R²=0.810)

由表5可知，校正後的總體模型在α=0.01的水平上F檢驗達到了極顯著，總體模型擬合得很好，因此可進一步對各個因素進行方差分析，確定各個因素對效價影響作用的大小。由方差分析表可知，5個因素對中生菌素的發酵效價都有極顯著影響，其影響次序依次為KH₂PO₄ >葡萄糖>氯化銨>穀氨酸鈉>可溶性澱粉。4對互作效應中，除葡萄糖與NH₄C1的互作對發酵效價無顯著影響之外，其它3對互作都有顯著影響，其次序依次為葡萄糖×KH₂PO₄>穀氨酸鈉×葡萄糖>穀氨酸鈉×KH₂PO₄。 

對表6進行分析並結合多重比較的結果(在此沒表3氮源篩選實驗結果有列出)可知，5個因素的最佳組合為：穀氨酸鈉選擇水平l，葡萄糖選擇水平2，KH₂PO4選擇水平1，NH₄C1選擇水平l，可溶性澱粉選擇水平3 ，即合成培養基配方為穀氨酸鈉0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性澱粉1.5％，NH₄C1 0.3％，KH₂PO₄   0.02 ％，Mg SO₄   0.025％， NaCl  0.5％，CaCO₃  0.3％，再加入微量元素。 

2.3合成培養基中中生菌素產生菌發酵效價

為驗證篩選得到的合成培養基發酵產中生菌素的能力，對正交試驗中發酵效價較高的處理、篩選得到的培養基進行發酵對比，結果如表7 。 

表7 合成培養基驗證試驗結果

由表7可看出，優化得到的合成培養基的產素能力明顯高於正交試驗中發酵效價較高的6個處理，分別比4、13和25號處理高38.17％、45.31％和40.22％，可用於進一步的中生菌素產生菌生理生化特性研究。 

3 討論

進行正交試驗時，處理4和13的發酵效價均達2000單位，而在驗證試驗時卻隻有1200個單位左右，2次實驗間的重複性不好。這可能是由於搖瓶實驗的影響因素眾多，每批實驗條件都不可能做到完全一致。如：一批配製的培養基，而且在同一搖床、同一恒溫間培養，等到放瓶時結果就有差別，而批次之間的差異更難控製。因此，在實驗過程中，就需要嚴格控製實驗條件。比如，培養基必須是同一批配製的；接種量保持均勻一致，將種子液盡量混勻後再接種；種子液的年齡和濁度要保持批次之間的一致性等。 

目前，在中生菌素產生菌分類鑒定、有效成分鑒別、抗菌活性、毒理測定、作用機製、發酵生產、劑型創製、田間推廣應用等方麵取得了很大進步，但有關中生菌素生物合成過程中該菌的產素機製、生理學及遺傳學研究尚少，在這些領域研究進展緩慢的原因之一就是使用天然培養基，其中成分的複雜性妨礙了對實驗結果的正確分析和判斷。本文開發出的合成培養基的發酵效價雖然與天然成分培養基有較大差距，但是合成培養基容易控製已知成分，確保了對實驗結果進行比較準確和可靠地分析，在中生菌素的生產和理論研究中都具有一定意義，可以彌補天然成分培養基成分易變，實驗結果分析困難的缺點。 

參考文獻 ：略

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