阪崎腸杆菌生長特性及耐熱耐酸堿性分析

摘 要：

目的 研究不同阪崎腸杆菌菌株的生長特性和耐熱耐酸堿性。

方法 采用光譜掃描儀培養22株阪崎腸杆菌，由掃描儀實時監測不同阪崎腸杆菌菌株生長特性；采用顯色平板塗布方法觀察高溫和酸堿條件下阪崎腸杆菌存活情況。

結果 傳統平板計數法和微孔板光譜掃描儀建立的阪崎腸杆菌生長曲線具有良好相關性( R²=0.92 )；22株阪崎腸杆菌經75℃處理2 mi n後。尚有1株存活；經堿處理後( pH12.55 ) 立即檢測，所有菌株均已死亡；用酸處理1 mi n後( pH1.18 ) 檢測， 尚有2株存活。

結論 采用光譜掃描儀方法測定阪崎腸杆菌生長曲線方便快捷，不需要培養計數；不同的阪崎腸杆菌菌株具有不同的耐熱、耐酸特性。 

阪崎腸杆菌(Enterobacter  sakazakii) 是一種有周生鞭毛、能運動、無芽孢、兼性厭氧的革蘭陰性杆菌，以前稱為黃色陰溝腸杆菌。食品中的阪崎腸杆菌汙染受到全世界關注。目前關於阪崎腸杆菌生長特性、耐熱耐酸堿性方麵的觀察方法及結果不盡一致。本文采用光譜掃描儀測定阪崎腸杆菌含量，研究阪崎腸杆菌生長特性與耐熱耐酸堿性。

結果報告如下。 

l 材料與方法

1.1 材料    ( 1 ) 菌株：阪崎腸杆菌菌株22株[中國檢驗檢疫 科學研究院下設的食品微生物菌種保藏庫( IQCC ) ] ， 其中4 株為美國模式菌種收藏中心菌株，另外l 8株分離自不同食品 產品。( 2 ) 主要試劑： 阪崎腸杆菌顯色底物( X—α—D—glu —copyranoside．北京路橋技術有限責任公司) ； 腦心浸液( BHI ) 培養液： 稱取37gBHI 溶解於1000 ml水，高溫煮沸溶解，高壓鍋121℃滅菌15 min，備用；腦心浸液培養基，稱取18.5g  BHI 和9～12g瓊脂， 0.04g 顯色底物溶解於500 m l水， 高溫溶解，高壓鍋121℃滅菌3min，備用。( 3 ) 主要儀器設備： 無菌操作台(美國Baker公司) ； 三洋IS600培養箱， 高壓滅菌鍋(日本三洋公司)； Labsysteml500光譜掃描儀(美國Thermo公司) 。 

1.2方法

1.2.1阪崎腸杆菌菌株生長曲線觀察  采用光譜掃描儀測定阪崎腸杆菌含量。將阪崎腸杆菌菌懸液進行稀釋至1 CFU／g 。吸取30μl菌懸液至96孔微孔板的每孔中，然後加入270μl 腦心浸液( 含有顯色底物) 培養液。將96孔板放入掃描儀中，設定培養溫度為37℃，測定波長為600min，測定時間間隔為0.5 h ，測定前振動10S，測定時間8h ；由掃描儀實時掃描自動生成阪崎腸杆菌8h內生長曲線。采用同一方法分別測定每株阪崎腸杆菌生長曲線，均重複測定3次。以300μl不含有阪崎腸杆菌的腦心浸液作為空白對照。采用平板計數法計數不同培養時間各試管中阪崎腸杆菌數量；以生長時間為橫坐標，以阪崎腸杆菌數量的對數為縱坐標。 建立阪崎腸杆菌生長曲線。比較2種方法下阪崎腸杆菌生長變化情況。

1.2.2 阪崎腸杆菌熱耐受性觀察  按照說明書配製奶粉溶液，煮沸3次滅菌。吸取10ml奶粉溶液到滅菌試管中，分別置65，70，75℃水浴鍋中，隔幾分鍾搖勻1次；3個溫度條件下分別放置20, 3，2min。使奶粉溶液分別均勻達到65，70，75℃；然後各加入1μl阪崎腸杆菌，50min後取出，室溫放置。待冷卻至室溫後，搖勻，吸取1ml 菌懸液至9ml腦心浸液培養液中過夜培養，觀察培養液有否渾濁。如果未渾濁表明沒有阪崎腸杆菌存活； 如果出現渾濁， 則吸取0.1m1 懸濁液塗布到顯色培養基，3 7℃倒置培養過夜後，檢查阪崎腸杆菌是否生長。

1.2.3阪崎腸杆菌菌株酸堿耐受性觀察   吸取10 ml 奶粉1 溶液到滅菌試管中，分別加入1ml的HC1 溶液和8％的NaOH，使pH分別達到約1.18 ，12.55 。混勻後，加入1μl阪崎腸杆菌，立即或加入HC1 後靜置1min，吸取1ml 菌液加入到9 ml 腦心浸液培養液中， 過夜培養複活。如果培養液未渾濁，表明沒有阪崎腸杆菌存活；如果培養液渾濁。則吸取 0.1ml懸濁液塗布到顯色培養基，37℃倒置培養過夜後， 檢查阪崎腸杆菌是否生長。 

1.3 統計分析  采用Excel 表進行統計分析。 

2 結 果

2.1  2種方法監測阪崎腸杆菌生長曲線比較   ( R  =0.92 ， P<0.01) 。

在相同培養條件下，可以由A值計算阪崎腸杆菌數量，也可以由A值和培養時問建立生長曲線，不需要取樣後塗平板進行培養計數。隨著時間延長，阪崎腸杆菌數量迅速增加，處於對數生長期。但培養8h後，阪崎腸杆菌數量增加趨緩。 

2.2阪崎腸杆菌隨時間生長特性 

采用光譜掃描儀測定7株分離自不同食品樣品生化反應不同的阪崎腸杆菌生長情況； 以細菌達到穩定生長所需時間作為穩定生長時間( Ts ) ，用以衡量細菌生長的快慢。結果表 明，37℃培養時。不同阪崎腸杆菌菌株，其穩定生長時間( Ts )也不同，表明菌株生長快慢不同，但到培養末期時，其中幾株生長較快的菌株數量差異無統計學意義 。 

2.3阪崎腸杆菌菌株的熱耐受性  結果顯示，22株阪崎腸杆菌65℃處理50min後，存活9株；70℃處理3min後，存活4株；75℃處理 2min後，存活1株。表明不同的阪崎腸杆菌菌株具有不同的熱耐受性。 

2.4阪崎腸杆菌菌株的酸堿耐受性  結果顯示，對22株阪崎腸杆菌進行堿處理後(pH 12.55 ) 立即檢測，所有菌株均已死亡；用酸處理30s後( pH1.18 )檢測，除1株死亡外其他菌株均存活；用酸處理1 min後( pH1.18 ) 檢測，除了2株存活外。其他菌株均死亡。表明阪崎腸杆菌對酸有一定耐受性，不同阪崎腸杆菌菌株對酸的耐受性不同。 

3 討 論

文獻報道, 依據阪崎腸杆菌菌株的生化特性以及在嬰幼兒配方奶粉溶液中的熱耐受情況，可以將阪崎腸杆菌菌株分為熱耐受和不耐受2種表型。本研究發現，分離自不同食品產品的阪崎腸杆菌菌株具有不同的生長特性、熱耐受性和酸堿耐受性。提示有些阪崎腸杆菌菌株對於高溫消毒和酸堿殺菌劑具有更強的耐受性。例如，巴氏消毒奶是牛奶經 62～65℃下處理30min ， 或72～75℃下處理15s後的牛奶，而對於一些熱耐受力較強的阪崎腸杆菌菌株，這種消毒方法無法達到徹底殺滅的目的，可能需要采用如超高溫瞬間殺菌 (UHT ) 等方法， 即將牛奶迅速加熱到135℃保持2～4s 等其他滅菌方式才能較徹底地消除阪崎腸杆菌。 

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