【 摘要】 阪崎腸杆菌屬腸杆菌科腸杆菌屬，是人和動物腸道內寄生的一種革蘭陰性無芽胞杆菌，屬條件致病菌，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血症，死亡率高達50％以上。阪崎腸杆菌耐酸、耐高溫、耐幹燥，對外界環境有較強的抵抗力。阪崎腸杆菌的微生物學檢驗方法，包括傳統細菌學培養方法及各種基於聚合酶鏈反應( PCR) 的分子生物學方法。 ．
阪崎腸杆菌(Enterobacter Sakazakii ) 是人和動物腸道內寄生的一種革蘭陰性無芽胞杆菌，屬腸杆菌科腸杆菌屬，一直被稱為黃色陰溝杆菌( Yellow Pigmented Enterobacter cloacae )， 直到1980年才由FARMER和他的同事更名為阪崎腸杆菌。因阪崎腸杆菌是腸道正常菌群中的一種，屬條件致病菌，一直未被臨床引起重視，直到1961年，英國的URME NYI和FRANKLIN 兩位醫生首次報告了由該菌引起的兩例腦膜炎病例，隨後丹麥、美國、荷蘭、希臘、冰島、比利時等國家相繼報道了新生兒阪崎腸杆菌感染事件。阪崎腸杆菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、菌血症和壞死性小腸結腸炎，並可能遺留嚴重的神經係統後遺症，死亡率20％～50％。國外文獻報道最多的是阪崎腸杆菌汙染了嬰兒配方奶粉，引起嬰幼兒感染。也有幾例成年人感染病例的報告。阪崎腸杆菌分離檢測方法，國際上通常以美國FDA 2002年8月發布的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸杆菌的分離計數” 作為經典方法，在此基礎上做了較多的改良方法及分子生物學檢測方法。我國也與2005年8月頒布了奶粉中阪崎腸杆菌檢測方法。臨床上對阪崎腸杆菌的病原學檢測方法報告較少。本文就阪崎腸杆菌的主要微生物學特性，致病性，分離檢測作一綜合性介紹，以飧讀者。
1 阪崎腸杆菌微生物學特性
1.1形態染色 阪崎腸杆菌屬腸杆菌科腸杆菌屬， 因此本菌具備腸杆菌基本形態特征：革 蘭陰性粗短杆菌，細胞大小為( 0.6～1.1 )×( 1.2～ 3.0 )， 有周身菌毛，無芽胞， 有動力。
1.2 培養特性
12.1 營養要求 不高，能在普通營養瓊脂、血平板、麥康凱( MAC )瓊脂、伊紅美蘭( EMB) 瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養基上生長繁殖。
1.2.2 培養溫度 阪崎腸杆菌具有耐熱及耐寒性，在外界環境中比其他腸道杆菌生存率強，培養最佳溫度25—36℃，在6～45℃下都能生長，某些菌株可在47℃下生長 。
1.2.3 菌落特征 在胰蛋白腖瓊脂( TSA)、腦心浸液瓊脂(BHI )及血平板上經 25～36℃培養24 h後，形成1.5～2.5 mm，黃色菌落， 菌落形態有2種：一種為典型的光滑型菌落，極易被接種環移動，另一種為幹燥或粘液樣，周邊呈放射狀，不易被接種環移動，似橡膠狀有彈性。後一種經傳代後可轉化為有光澤的菌落。
1.2.4 菌落顏色 阪崎腸杆菌在MAC瓊脂上為無色透明菌落，在TSA及BHI上生長為黃色菌落，在結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBG) 能產生紫紅色菌落，而在TSA上加 5- 溴-4-氯-吲哚-α- D- 吡喃葡萄苷( Xα-GLC ) 僅阪崎腸杆菌能產生蘭綠色菌落，現已作為阪崎腸杆菌快速培養的選擇性培養基，在4-甲基- 傘形酮-α- D- 葡萄糖苷( NA+α-MUG) 培養基上產生熒光菌落。
1.3 生化反應 阪崎腸杆菌在定名前一直被伯傑分類為產黃色素的陰溝腸杆菌，實際上是陰溝腸杆菌的一個亞種，因此與陰溝腸杆菌的生化反應有許多相似的地方。阪崎腸杆菌與陰溝腸杆菌有31％～49％的DNA序列同源性，G+C含量為57％。
MUYTJENS等在對226株(其中129株為阪崎腸杆菌，其他為陰溝腸杆菌60株，產氣腸杆菌19株，聚團腸杆菌18株)腸杆菌的研究中，發現阪崎腸杆菌和其他腸杆菌之間存在兩個主要的不同：阪崎腸杆菌α-葡萄糖酶苷活性均陽性，而缺乏磷酰胺酶活性。由此認為，憑兩種酶活性檢測可將阪崎腸杆菌與其他腸杆菌明顯地區分開來，並且將α-葡萄糖酶苷活性檢測可用來快速分離阪崎腸杆菌。
POSTUPA研究了從嬰兒配方奶粉中分離到的6株阪崎腸杆菌，發現所有的菌株都能產生吐溫-80脂酶。因此， 吐溫-80脂酶活性測定也可以作為阪崎腸杆菌的鑒定依據。
1.4. 抵抗力
1.4.1 耐高溫、幹燥、滲透壓 阪崎腸杆菌比其他腸杆菌耐高溫，LEHNER 研究發現阪崎腸杆菌在嬰兒配方奶粉中60℃存活2.5min，並且72℃仍能存活。BREELLWER等觀察阪崎腸杆菌在58℃下能持續0.39～0.60min不死。由於阪崎腸杆菌細胞內含有大量的海藻糖酶，累積有大量的海藻糖，使得阪崎腸杆菌比沙門菌和其他腸杆菌更耐受滲透壓和幹燥。因阪崎腸杆菌這些特性，使得奶粉生產時不易被殺滅，儲存時易生存下來。
1.4.2 耐酸性並對清潔劑和殺菌劑有較強抵抗力LEH—NER的實驗表明，阪崎腸杆菌能在 pH0.9～2下存活(胃部的酸性環境)，可能與阪崎腸杆菌周身菌毛結構有關，該菌毛結構易使細菌形成共生集合體，也易粘附在各種物體表麵形成一層生物保護膜，對清潔劑和殺菌劑具有較強的抵抗力。
2 阪崎腸杆菌臨床意義
阪崎腸杆菌可引起各年齡段人群的疾病，但從已報道的病例年齡分布來看，嬰幼兒(1歲以下的兒童)是該菌感染的高危人群，特別是新生兒、早產兒、出生體重偏低、免疫力低下等身體狀況較差的嬰兒。感染主要引起腦膜炎、膿毒血症、壞死性小腸結腸炎；阪崎腸杆菌引起的腦膜炎常引起腦梗塞、腦膿腫和腦室炎等並發症，並且可引起神經係統後遺症，死亡率較高。成人主要是引起局部感染和菌血症。
2.1 致病因素 文獻對阪崎腸杆菌的致病因素報道不多，所知甚少。目前所知阪崎腸杆菌致病性與類腸毒素和內毒素有關。PAGOTTO首先描述阪崎腸杆菌可能產生一種毒力因子——類腸毒素樣化合物，經腹腔注射板崎腸杆菌劑量達10CFU／隻時。18株實驗菌株均可導致乳鼠死亡，其中4例檢測到類腸毒素樣化合物。國內許龍岩等觀察小鼠在接種阪崎腸杆菌菌液6小時後出現中毒症狀，8小時後中毒症狀加深，24小時後全部死亡。經解剖發現實驗鼠小腸腫脹，有氣泡，腸壁變薄、糜爛，腸係膜血管、腹膜血管變粗、充血。最近，TOWNSEND 等發現嬰兒配方奶粉中含有細菌脂多糖——內毒素(LPS )，具有熱穩定性，能增加小腸上皮細胞通透性，促使細菌侵入腸壁中而致病。他將純化的腸杆菌屬脂多糖與阪崎腸杆菌一起經注射入乳鼠腹腔中，能明顯提高阪崎腸杆菌穿透血腦屏障的能力，該實驗雖未明確表明阪崎腸杆菌產生內毒素，但推測阪崎腸杆菌的致病性與細菌內毒素有明顯的關聯。
MANGE等通過體外組織細胞培養實驗觀察到阪崎腸杆菌對人類上皮細胞和腦微血管內皮細胞有吸附粘連特性，並形成叢生，表麵形成生物保護膜。
KIM等支持上述實驗結果，他們利用不鏽鋼管、玻璃管及PVC塑料管腔內壁，隻要有一定營養液和適宜溫度，阪崎腸杆菌就可以在這些管腔內吸附生存，並形成生物保護膜，抵禦消毒劑等的殺傷作用。
2.2 所致疾病
2.2.1 嬰幼兒腦膜炎 自從1961 英國的FRANKHN等首次報道了2例由阪崎腸杆菌(當時被描述為產黃色素陰溝腸杆菌)引起的腦膜炎病例，隨後世界各國陸續報道了由該菌引起的嬰幼兒腦膜炎。1983年MUYTJENS等對荷蘭地區6年來發生的8例阪崎腸杆菌引發的嬰幼兒腦膜炎作了回顧性調查分析。發現未足月出生的新生兒占75％，出生時低體重 (<2000g )的新生兒易感染(6／8)，並與人工喂養奶粉有關。主要症狀：發熱、麵色蒼白，有抽搐或顫抖，張力亢進，囪門隆出，無頸項強直。合並有菌血症者占5／8，壞死性小腸結腸炎占2／8，死亡率高達75％(6／8 )。2例存活的病人中伴有嚴重的神經係統後遺症。在大部分病例的腦脊液和血液中分離到阪崎腸杆菌。Biefing等在1989年報告了3例住在冰島首都國立大學附院新生兒重症監護室病人，1例正常出生但伴有左腦損傷，1例是Down’s 綜合症(先天性無肛門)，另1例為健康的男性雙胞胎之一，他們共同特征是人工喂養嬰兒配方奶粉5天後發病，出現發熱、精神萎靡、嗜睡、腦脊液可見大量的嗜中性粒細胞，培養分離均找到阪崎腸杆菌，除1例死亡外，1例發展為四肢癱瘓、癡呆，另1例為陣發性癲癇病。 BOWEN等分析46例阪崎腸杆菌感染的病例，其中腦膜炎的發病率是72％(33／42)，在33例的腦膜炎病例中有33％發展為癲癇，21％有腦膿腫，死亡率42％。
2.2.2 新生兒菌血症 該病例最早報告的是在1979年，MONROE 發現一出生6天(體重2600g)的患兒出現低熱(38.3℃)、寒顫，白細胞偏低，其血液培養分離到阪崎腸杆菌，經氨替比林治療後痊愈，未發生腦膜炎。
阪崎腸杆菌感染新生兒發生的菌血症，據BOWEN對46例該菌感染的新生兒分析，其發病率是38％(12／42 )。多數症狀較輕，如出現嚴重的膿毒血症，死亡率可達36％。
2.2.3 新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC) ACKER等報告了比利時一家醫院的新生兒重症監護室在1998年6—7月間共有12例阪崎腸杆菌引起的NEC暴發事件，12例NEC都經臨床確診，這些患兒的特點是：均未足月出生，體重全部低於2000g，最低體重590g，平均體重隻有1177g，人工喂食奶粉。胃液分離到阪崎腸杆菌7例(7／12)，肛指液分離到9例(9／12 )， 血液分離到4例(4／12)，死亡2例(2／12) 。
2.2.4 成人感染 阪崎腸杆菌引起成人感染的報告雖不很多，但從現有資料看涉及到成人各年齡段都有發生。本菌是條件致病菌，當機體因其他疾病導致免疫功能低下時，可引起菌血症、膿毒血症及泌尿道、呼吸道、創傷麵感染，也可引起腦膜炎、膽囊炎。周庭銀等報告的3例阪崎腸杆菌感染其中敗血症1例(女，45歲)，尿路感染1例(女，55歲)，中耳炎1例(男，21歲)。龔燕等報告從64例痰液中分離到阪崎腸杆菌，其中有62例(96.7％患有基礎疾病：慢性阻塞性肺疾病24例，呼衰7例，糖尿病6例，肺結核2例，肺癌2例，近期化療8例，腸梗阻2例)。最近，See等報告一個75歲老婦患多發性脾膿腫合並阪崎腸杆菌菌血症。
3 阪崎腸杆菌微生物學檢驗
3.1 細菌學分離培養方法
3.1.1 經典方法 所謂經典方法，即是美國FDA推薦的“三管法” 培養分離阪崎腸杆菌的方法。基本步驟如下：(1)以無菌稱取100、10、1g嬰兒配方奶粉用無菌蒸餾水以1：10稀釋，充分溶解後36℃24h 孵育；(2)充分混勻後分別取10 ml加入至裝有90mlEE肉湯增菌培養36℃24h；(3)充分混勻後用直接塗布法或直接劃線接種法，在VRBG平板中孵育36℃24h；(4)從每個VRBG平板中挑取5個可疑菌落，分別接種在TSA平板25℃48～72 h；( 5 ) 在TSA平板上挑取黃色、無光澤典型菌落在API20E進行鑒定。該方法自2002年被推薦公布以來，一直是各國沿用的阪崎腸杆菌鑒定檢測的方法，缺點是時間太長，需時7天左右，靈敏度不高。
3.1.2 改良法： XαGLC選擇性顯色培養基法 該法是利用阪崎腸杆菌α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法，在TSA培養基中加入了5-溴-4-氯-吲哚- α-D-吡喃葡萄苷( XαGLC)作為發色基團，組成顯色培養基，稱為(DFI) 瓊脂。該法的原理是葡萄糖苷酶水解XαGLC，釋放糖苷配基5-溴-4-氯- 吲哚，該糖苷配基在氧存在時形成色素溴-氯- 吲哚，使菌落呈現特異性藍綠色。該改良法已被廣泛應用，相對經典方法能縮短時間2天左右，且特異性高。
3.1.3 改良法： 熒光選擇性鑒別培養基法 該方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法。在營養瓊脂基礎上添加4-甲基-傘形酮-α- D-葡萄糖苷(α-MUG)。阪崎腸杆菌在該培養基上形成黃色菌落，在紫外光照射下發生熒光。該法靈敏度和特異性都比較好，已在多個國家開展使用，均取得穩定可靠的結果。
3.1. 4 改良法： 對硝基酚光電比色法 利用阪崎腸杆菌的α-葡萄糖苷酶活性，分解對硝基酚-α-D- 葡萄糖苷底物，釋放黃色的對硝基酚，在405 nm波長下測定吸光度，根據吸光度的大小，確定樣品中阪崎腸杆菌是否存在。方法是常規增菌，在VRBG或TSA平板上挑取可疑菌落，製備成一定濃度的菌懸液與底物混勻，37℃ 4h後進行比色測定。
3.1.5 陽離子磁性珠快速捕獲法 MULLANCE等設計了革蘭陰性杆菌捕獲係統，能快速富集阪崎腸杆菌。他將普通珠子經過順磁化後，使其表麵帶有陽離子(正電荷)，能極強地吸附帶有陰離子(負電荷)的物質；革蘭陰性杆菌表麵的脂多糖就是帶陰離子(負電荷)的物質，故陽離子磁性珠能捕獲含有脂多糖的革蘭氏陰性杆菌。MULLANCE將該係統設計成自動化，即將嬰兒配方奶粉溶解後，通過管道輸送至捕獲器，反複與磁性珠接觸，使阪崎等革蘭陰性杆菌被吸附在磁性珠表麵，然後在蛋白腖緩衝液中洗脫細菌；整個過程在6h內完成。然後將濃縮的菌液劃線，接種在選擇性顯色培養基(DFI) 或通過PCR分子生物學方法鑒定。使用該方法，最多在48h內鑒定出阪崎腸杆菌，比美國FDA經典方法縮短5天左右，並且靈敏度很高，可檢出1～5CFU／500g 奶粉。
3.2 分子生物學方法
3.2.1 PCR方法 IVERSEN等利用16SDNA基因序列的PCR方法，對126株被API20E和ID32E自動化鑒定為阪崎腸杆菌，其中有幾株是ATCC的標準菌株，進行了核苷序列分析。發現阪崎腸杆菌與柯氏枸櫞酸杆菌最接近，有97．8％同源，而與陰溝腸杆菌隻有97％同源； 利用16S DNA核苷序列分析，可將126株阪崎腸杆菌進一步分為四個亞群：與標準菌株相比，有0.1％-1.2％序列不同的分為I群，共有110株；有1.6％-1.9％序列不同分為Ⅱ群，共有9株；有97.5％-97.8％同源分為Ⅲ群，包括分類為Pyfinus腸杆菌、霍氏腸杆菌和柯氏枸櫞酸杆菌，共有5株；第 Ⅳ群僅2株，隻有96.5％同源性。
LEHNER等則采用針對16S rRNA基因序列的PCR方法。他們對47株不同來源的阪崎腸杆菌和28株其他腸杆菌進行了分析，經與基因庫標準菌株對比，47株阪崎腸杆菌有99.4％-100％同源性，28株非阪崎腸杆菌則全部陰性,特異性很強，靈敏度可達10 pg。
MANOJ等設計了針對阪崎腸杆菌外膜蛋白A基因(OmpA)序列的PCR方法，所設計的產物能特異性地擴增阪崎腸杆菌的DNA片段，擴增產物為469bp 。OmpA基因是阪崎腸杆菌具有的獨特性位點，其他G腸道杆菌無此基因。因此，該PCR方法特異性非常高，檢測靈敏度在嬰兒配方奶粉直接檢測可達10CFU／ml，如通過8小時培養則可達103 CFU／ml，是一種理想的快速檢測阪崎腸杆菌的方法。
3.2.2 定量PCR方法 定量PCR是在一般PCR法基礎上發展起來的一種分子生物學定量方法。目前國內外最常使用的是實時熒光定量PCR技術(real—time PCR )。最早使用該技術是上個世紀90年代美國PE公司開發的Taqman熒光探針定量技術，稱經典方法。之後在此基礎上發展出了雜交探針法，以及熒光引物法等。熒光定量PCR技術的基本原理是在PCR反應體係中加入熒光基團，該基團是一對合適的熒光物質，可以構成一個能量供體和能量受體對，其中供體的發射光譜和受體的吸收光譜重疊，在PCR反應基因擴增時，激發供體而釋放的熒光能量正好被受體吸收，使得供體的熒光強度減弱而受體熒光強度增強，利用熒光信號強弱變化積累實時監測整個PCR反應過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析。
實時熒光定量PCR技術已廣泛應用於多種食品微生物汙染的檢測。SEO等利用阪崎腸杆菌部分大分子合成( MMS )操縱子基因序列建立了奶粉中阪崎腸杆菌的實時熒光定量PCR方法，能檢測到0.6g-1奶粉中的阪崎腸杆菌，且比傳統培養法檢測時間從 6～7天縮短至2天內完成。對68株阪崎腸杆菌和55株非阪崎菌進行檢測，未出現假陽性和假陰性，具有很好的特異性。
4 小結
阪崎腸杆菌主要通過嬰兒配方奶粉傳播能引起嚴重的新生兒疾患，死亡率高達50％以上，已引起了FAO／WHO及各國的高度重視。近幾年國內也有陸續報道，根據筆者搜索到有關阪崎腸杆菌的文獻資料，國內外報道最多的是食品安全問題，臨床醫學界尚未引起足夠的重視，對阪崎腸杆菌對人體的致病因素、致病機理尚未深入研究；阪崎腸杆菌是條件致病 菌，在外界環境中的存在有較多研究，但對人體正常菌群中阪 崎腸杆菌的分布、阪崎腸杆菌的傳播、流行、耐藥等缺少相關資料。通過本文對阪崎腸杆菌的主要生物學性狀，致病因素，所致疾病、培養檢測方法等作了簡要綜述，望能引起醫學界同仁的廣泛關注，起到拋磚引玉作用。
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