不同培養基成分對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷含量積累的影響

      方法  改變培養基中碳源、氮源、磷酸鹽、鈣鹽的濃度，比色法測定愈傷組織中皂苷的含量。

      結果  金鐵鎖愈傷組織生長和皂苷積累的最適培養基成分為蔗糖40g· L^-1 ， KNO₃：NH₄NO₃為(1.9 ：1.65 ) g·L^-1 ， 1mmol·L-1  KH₂PO₄ ，4.5 mmol·L^-1CaC1₂ 。

       結論  蔗糖作為碳源最有利於金鐵鎖愈傷組織生物量的積累和金鐵鎖皂苷的生物合成。混合氮源有利於金鐵鎖愈傷組織生長和皂苷含量的積累。 

關鍵詞 ： 金鐵鎖； 愈傷組織； 皂苷含量； 培養基成分

金鐵鎖Psammosilenet unicoides  W．C Wu et C．Y Wu是石竹科金鐵鎖屬單種屬植物， 其根入藥，用於跌打損傷、胃痛、風濕痛、創傷出血等的治療，是我國中成藥保密品種“雲南白藥”的重要成分之一。金鐵鎖化學成分主要為三萜皂苷及環肽類化合物。研究稱金鐵鎖皂苷在抗炎鎮痛作用中效果顯著。近年來，由於自然生長慢、濫采濫挖、環境惡化、市場需求增加等多方麵原因，造成金鐵鎖資源數量急劇下降，成為《中國植物紅皮書》中的國家二級重點保護的珍稀瀕危物種。而利用組織培養技術生產金鐵鎖的替代產品，即可滿足市場的需求也是保護野生種質資源必由之路，成為解決金鐵鎖藥用資源匱乏問題的重要手段之一。 

目前，對金鐵鎖皂苷類物質的研究主要集中在其藥理藥效方向，對金鐵鎖愈傷組織培養過程中次生代謝產物調控的研究目前尚未見報道。本實驗通過改變不同培養基成分，研究金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷積累的規律，以期為利用組織培養技術規模化生產金鐵鎖皂苷類物質提供理論依據。 

1 材料

選取大連工業大學細胞工程實驗室盆栽金鐵鎖幼嫩莖為外植體。 

2 方法

2.1 愈傷組織誘導與培養   外植體經流水衝洗後用Tween 20浸泡25 min，衝洗3次， 0.1％HgCl₂ 處理 8min ，無菌水洗3次，經75％乙醇處理8s ，無菌水洗3次，無菌濾紙吸幹水分，然後切成 1 ～1.5 c m的莖段進行接種。所用誘導培養基為 M S固體培養基 ( 2，4一D 0.5 mg·L^-1 +NA A 0.5 mg·L^-1 +KT 0.1 m·L^-1 +3％蔗糖 +0.8％瓊脂，p H 5.8 ) ， ( 25±1)℃下暗培養。外植體接種6d左右，切口處開始膨脹；10 d左右開始長出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25 d時挑選質地鬆散、生長良好的愈傷組織，稱重後繼代培養，25d後收獲稱重。 

2. 2 金鐵鎖愈傷組織測量指標

幹重增量=最終收獲幹重 一 接種幹重量

金鐵鎖皂苷產量=幹重增量 ×金鐵鎖皂苷含量

鮮重稱量 ： 從培養瓶中取出愈傷組織， 用濾紙吸淨其表麵水分後稱重。幹重稱量： 將收獲的愈傷組織置於50℃下幹燥至恒重。實驗重複3次取平均值。 

2.3 金鐵鎖皂苷含量測定

2.3.1  金鐵鎖皂苷的提取 將獲得的愈傷組織幹燥粉碎並準確稱取2.00 g ， 加入20倍量80％乙醇超聲波(頻率：40 kHz，功率：500W) 提取100 min ，過濾得醇提液，揮幹試劑得醇提物。將此醇提物用適量水溶解，用正丁醇( 4：3：3 ) 萃取3次。正丁醇萃取液蒸發至幹， 用甲醇溶解並定容至10m l，得金鐵鎖皂苷提取液。 

2.3.2 金鐵鎖皂苷含量的測定 目前國內尚無金鐵鎖皂苷類成分的法定對照品，本實驗選擇人參皂苷Re為對照品，采用香草醛一高氯酸比色法測定金鐵鎖總苷含量。 

對照品溶液的製備：精密稱取人參皂苷R e 標準品5 m g，加甲醇10 ml，振蕩，搖勻， 待用。 

標準曲線的繪製：分別吸取0.1，0.2 ，0.3 ，0.4，0.5，0.6，0.7m1 人參皂苷 Re對照液置於具塞試管中，水浴揮幹試劑，加入5％ 香草醛一高氯酸溶液0.2 ml 和高氯酸0.8 m l ， 65℃下水浴20 min ，立即用冰水冷卻至常溫， 加入5 m l 冰醋酸，搖勻靜置後於λ= 540 nm下測定吸光度，以樣品濃度為橫坐標，吸光度縱坐標，繪製標準曲線。以此方法得回歸方程為：A=1.628  3C一0.0023， r=0.9991。 

金鐵鎖皂苷含量測定： 精取金鐵鎖皂苷提取液 0 ． 5   m l ， 置於 具塞試管中， 按標準曲線操作。用回歸方程計算金鐵鎖皂苷的含 量， 折算成愈傷組織中的含量和每升培養基的產量。 

3 結果

3.1 不同碳源對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷含量積累的影響

由表1可知，蔗糖作為碳源對金鐵鎖愈傷組織的生長及皂苷積累影響作用最為顯著。白砂糖影響效果次於蔗糖，但明顯高於麥芽糖和葡萄糖。 

表 1   不同碳源對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷含量積累的影響

碳源濃度為30g·L^-1 

3.2 不同蔗糖濃度對金鐵鎖愈傷組織生長和皂苷含量積累的影響   幹重增量和皂苷產量均隨蔗糖濃度增加而增大，在蔗糖40～50g·L^-1的時候達到最高，隨後隨濃度增大而迅速降低。綜合分析，以蔗糖40g·L^-1為最優碳源濃度。 

3.3 氮源對金鐵鎖愈傷組織生長和皂苷含量積累的影響  由表2可知， KNO₃與NH₄NO₃  混合添加的時候，幹重增量達到最高皂苷含量積累也呈現較優狀態。單獨加KNO₃作用效果不明顯單獨加NH₄NO₃ 作用效果較好並隨濃度增加而增大。綜合分析混合氮源利於金鐵鎖愈傷組織生長和皂苷的積累，KNO₃：NH₄NO₃為 ( 1.9：1.65) g·L^-1 時效果最佳 。 

表 2 氮源對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷含量積累的影響

氮源單位為 g·L^-1 ， 總氮濃度為 60 mmo l·L ^-1

3.4 不同濃度磷酸鹽對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷積累的影響

由圖2可知， 在 KH₂PO₄ 於1.00 mmol·L^-1時，金鐵鎖愈傷組織幹重增量和金鐵鎖皂苷產量增加迅速，在1.00 mmol·L^-1時兩者達到最高，並隨著濃度增加而減小。因此，KH₂PO₄濃度為 1 mmol·L^-1 時為愈傷組織生長和金鐵鎖皂苷合成的最佳濃度。 

3.5 鈣鹽對金鐵鎖愈傷組織生長及皂苷積累的影響  愈傷組織幹重增量隨著CaC1₂ 濃度的增加而增大，在濃度為 4.5 mmol·L^-1  時達到最大，大於4.5 mmo l·L^-1時隨著濃度增加而減少。皂苷量在CaC1₂濃度為3 mmol·L^-1之前增加迅速， 在3～4.5 mmol·L^-1 時相差不大，均處於較優狀態，大於4.5 mmol·L^-1時隨濃度增加而減少。綜合考慮，CaC1₂濃度為4.5 mmol·L^-1 時為最佳濃度。 

4 討論

培養基成分對愈傷組織的生長及次生代謝產物的積累具有重要影響。碳源是細胞生長的能量來源及構成細胞骨架的重要成分，培養基中糖類不僅起到碳源作用，還可以調節細胞滲透壓，其種類及濃度對細胞生長及次生代謝產物的積累影響顯著。研究表明，金鐵鎖愈傷組織培養中蔗糖為最佳碳源，其中4％的蔗糖濃度最有利於細胞生長及皂苷物質的積累。同等條件下，蔗糖培養的愈傷組織幹重增量及皂苷產量均明顯高於葡萄糖和麥芽糖，可能是蔗糖作為兩分子糖比單一葡萄糖作用要更為全麵。同時發現蔗糖和白砂糖的作用效果較為相似， 進行規模化生產開發金鐵鎖時可選用白砂糖為碳源，以降低生產成本。氮是細胞核酸及生物體內酶的重要組成成分，主要以氨態氮( NH₄⁺ ) 和硝態氮( NO₃^- ) 兩種形式存在，在植物體內先轉化為氮基酸在轉化為蛋白質後被植物吸收利用。其種類及濃度對細胞生長及次生產物合成具有顯著效果。本實驗研究發現，單獨使用NH₄NO₃或兩者混合使用效果均優於單獨使用KNO₃，說明混合氮源利於金鐵鎖愈傷組織細胞生長及皂苷產物的合成，KNO₃：NH₄NO₃  的最優質量比值為1.9：1.65g·L^-1。磷元素在生命活動中具有重要地位，植物細胞培養中通常由磷酸鹽提供細胞活動所需磷元素。本研究中，1 mmol·L^-1 KH₂PO₄最有利於金鐵鎖愈傷組織生物量積累及皂苷產物的合成。鈣離子作為細胞生長的必須營養元素，在植物細胞中起著重要的信使作用，調節著細胞的生長及次生代謝產物的合成。本研究發現，影響金鐵鎖愈傷組織細胞生長及皂苷產物積累的最佳鈣離子濃度為4.5 mmol·L^-1  

本文通過研究不同碳源、氮源、磷酸鹽和鈣鹽對金鐵鎖愈傷織生長及皂苷含量積累的影響，明確了金鐵鎖細胞培養的適宜條件，為下一步大量培養金鐵鎖愈傷組織及規模化生產金鐵鎖皂苷物質奠定了基礎。

參考文獻（略）

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