不同培養基對腸毒素大腸杆菌疫苗株產生菌毛的影響

【 摘要 】  目的通過比較不同培養基對疫苗株產生菌毛的影響，獲得一種有利於細菌生長和菌毛產生，而且費用低廉的培養基。方法 通過測定培養物的密度，觀察疫苗菌株的生長規律，用斑點ELIS A和全菌ELISA檢測菌毛抗原的表達情況。結果LB培養基既有利於疫苗株的生長，又有利於細菌菌毛的表達。結論 LB培養基可以用於疫苗株中試和大規模培養。 

【關鍵詞 】 腸毒素大腸杆菌；疫苗株；培養基；斑點ELISA；菌毛

近些年來，腸毒素大腸杆菌( ETEC )疫苗候選株的研製主要是針對激發抗定居因子菌毛的腸道抗體和中和熱敏腸毒素的抗毒素，包括滅活的產菌毛的ETEC和純化的菌毛。由於死菌苗保護時間較短，以減毒的痢疾菌和沙門氏菌等為載體的ETEC疫苗應運而生。 

本文以誌賀氏痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脫氫酶)基因突變株為載體宿主，運用宿主/質粒平衡致死係統，構建了表達ETEC菌毛抗原和腸毒素抗原的活菌口服疫苗候選株。動物實驗結果表明，疫苗候選株具有良好的免疫應答反應。本研究的目的是尋找一種既適宜於疫苗株生長，又有利於菌毛表達的廉價培養基，為疫苗的大規模生產奠定基礎。 

材料與方法

1．菌株

產生ETEC   CFA1／CS6菌毛的疫苗候選株FE16以及產生ETEC  CS3菌毛和腸毒素融合蛋白的疫苗候選株FE3；誌賀氏痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脫氫酶)基因突變株 FWL01。

2．培養基

CFA培養基(水解酪蛋白10g／L，酵母粉1．5 g／L ， MgSO₄·7H₂O  0.05 g／L，MnCl₂  0.005g／L。調pH至7.4 )；LB培養基(酵母提取物5g／L，胰蛋白腖10g／L，NaCl  10g／L，調pH至7.4 )；進口TS培養基(Tryptone  15g/ L，Soytone 5g/L，NaCl 9g／L，pH 7.4 )和國產TS培養基(胰蛋白腖15g／L，大豆蛋白腖5g／L，NaCl  10g／L，pH 7.4 )。水解酪蛋白為DIFCO產品；酵母粉和酵母提取物為OXOID產品；胰蛋白腖和大豆蛋白腖為北京雙旋微生物培養基製品廠產品。 

3．抗體

抗CS3單克隆抗體由瑞典Gobebourgs大學Svennerhom教授惠贈；CFA多克隆抗體係本研究室製備；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠及羊抗兔IgG購自Sigma公司。 

4．細菌培養

將疫苗候選株FE3或FE16  37℃過夜(16～18h)的培養物，按1％的接種量接種於含有100ml培養基的三角瓶內，在37℃下震蕩(190～200r/min)培養，每2h取樣測定A₆₀₀，直至12h達到對數生長期 為止。 

5．斑點 ELISA 

每2h取的樣品，分別取5μl進行倍比稀釋，逐次點在0.45μm硝酸纖維素膜上。用含2％牛血清白蛋白和0.05％Tween20的PBS封閉，室溫30min。用PBST(PBS-0.05％Tween20)緩衝液洗1次，置於用封閉液稀釋的抗體中(抗CS3為單克隆抗體，1：3000稀釋，抗CFAI 多克隆抗體1：1000稀釋)，室溫作用1 h。用PBST緩衝液洗5次。再置於用封閉液適當稀釋的羊抗鼠HRP-IgG(針對抗CS3單克隆抗體)或羊抗兔HRP-IgG(針對抗CFA/1多克隆抗體) 中，室溫作用30min。用PBST緩衝液洗5次。最後，加入酶底物溶液(0.05％Tris—HCl，pH7.4，  0.5mol／L  NaC1，0.06％二氨基聯苯胺，0.2％H₂O₂)顯色。待顯色適度後，用2mol/ L  H₂SO₄  終止反應，水漂洗後陰幹並觀察結果。 

6 ． 全菌 ELISA 

將上述不同培養時間取樣的細菌培養物，於8000r/min  4℃離心5min， 然後用包被液( NaHCO₃  2.93g/L，Na₂CO₃ 1.95g/L，pH9.6)懸浮菌體並調整菌懸液的濁度均為A=1.0。用菌懸液包被酶聯板，100μ/孔，於4℃包被過夜。用PBST(PBS緩衝液加 0.05％Tween 20)洗滌3次。每孔加入200μ/L 3％封閉液( PBS緩衝液加3％牛血清白蛋白和0.05％Tween20)， 放置37℃保溫1h。用PBST洗3次，每孔加入100μl適當稀釋的抗CS3的單克隆抗體或抗 CFA/1多克隆抗體，置37℃保溫1h。用PBST洗滌3次，每孔加入100μl適當稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG，置37℃保溫1h。用PBST洗滌3次，每孔加入100μl底物顯色液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液[NaHPO₄  0.05mol／L，檸檬酸0.24mol／L， pH 5.0 ] 10ml 加鄰苯二胺 4mg和15μl  30％H₂O₂ ) 。待顯色適度時，每孔加入50μl  2mol／L  H₂SO₄終止反應，並用酶聯儀測定A₄₉₂值。 

結  果

1．疫苗候選株生長曲線

產腸毒素大腸杆菌基因工程疫苗FE16和FE3是以痢疾疫苗株FWL01 (T-32的asd基因插入滅活突變株)為宿主載體，分別克隆表達了產腸毒素大腸杆菌的CFA/1、CS6菌毛和CS3菌毛及兩種腸毒素融合抗原。為了研究重組菌株的生長規律，用LB培養基在37℃條件下振蕩培養。盡管FE16和FE3表達了外源抗原蛋白，但其生長曲線與載體宿主 FWL01仍無顯著差異 。 

2 ． 不同培養基對疫苗候選株生長的影響

比較了4種培養基對疫苗候選株FEl6和FE3的影響，FE3在不同培養基中的生長情況。FE16了生長稍微旺盛外，與FE3本相同(結果未列出)。經3次實驗的結果表明，LB和CFA培養基較之TS培養基更適合疫苗候選株 FEl6和FE3的生長。 

3．不同培養基對疫苗候選株產生菌毛的影響

經斑點ELISA檢測FE3疫苗株在不同培養基的CS3菌毛產生水平，結果以LB培養基最高。將FE3培養物稀釋到A₆₀₀ =1.0，用ELASA檢測3次結果均表明LB培養基有利於菌毛產生。 ( FEl6產生FA1的水平與上述結果基本接近) 。 

表 1  FE3疫苗株在不同培養基產生 CS3菌毛水平

討  論

腸毒素大腸杆菌是造成發展中國家嬰幼兒和旅遊者細菌性腹瀉最主要的致病菌之一。其菌體表麵的菌毛抗原是首要保護性抗原。ETEC疫苗的研究已有近20年的曆史，至今仍沒有理想的疫苗用於人體。本研究構建的載體活菌疫苗，特點是免疫接種後靠重組菌在機體內繁殖產生保護性抗原，刺激機體產生特異性免疫性反應，同時活菌還起佐劑作用，是一種比較理想的疫苗類型。通過比較不同培養基對疫苗株產生菌毛的影響，發現實驗室常用的成分 簡單、費用低廉的LB培養基無論是在細菌生長密度還是在菌毛表達方麵，都適合本課題研究開發的新型致腹瀉性研EC載體疫苗的培養，為今後疫苗的中試及大規模生長奠定了良好基礎。以往為了利於野生型研EC產生菌毛，一般采用CFA培養基。而本實驗結果表明，LB培養基像CFA培養基一樣，有利於以痢疾杆菌為載體宿主的腸毒素大腸杆菌菌毛的產生。 

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