厭氧菌感染的檢查

1.厭氧菌的分離與鑒定

　　(1)標本的采集與運送：厭氧菌為人體普遍存在的正常菌群，尤多見於腔道口黏膜組織，因此標本采集過程中應避免為正常菌群所汙染。標本應從正常無菌部位或通過嚴格無菌操作采取，如血液、胸腹腔液、心包液、腦脊液、關節液，以及通過外科無菌手術抽得的膿液;或通過特殊技術，如經纖維支氣管鏡取得的下呼吸道標本、由陰道後穹隆抽出的盆腔膿液等標本均不接觸正常菌群，因而都屬合格的標本。至於口腔和鼻咽拭子、肛拭和陰道拭子、胃與小腸內容物、咳出的痰液、未經局部消毒而排出的尿、流出的膿等標本一般不作厭氧培養，因已有汙染可能，檢出結果無參考意義。為避免接觸正常菌群，不同部位的標本有特殊的采集方法;肺部感染痰液標本，在有經驗者以經氣管直接穿刺抽取較為可靠，但在嚴重缺氧，有出血傾向和劇咳的患者禁忌;尿液標本以經皮膚從恥骨上穿刺取得為可靠，但此法臨床難以推廣，目前仍以清潔中段尿為主;女性生殖道感染標本收集時應先清潔消毒陰道和宮頸，小心擴張宮頸口，然後以外套消毒指套的針筒或無菌塑料套管伸入宮頸管或宮頸內吸出分泌物，或可作子宮直腸窩穿刺，可得未汙染的標本;鼻竇、其他竇道或深傷口等，可在皮膚消毒後，用空針連著導管盡可能深入抽取。懷疑有敗血症者，應在用抗菌治療前短期內采血2～3次，采血量多，陽性率高，一般血液與培養液的比例以1∶10～1∶20為宜;抗凝劑以選擇多聚茴香磺酸鈉為宜，因其具有抗補體、抑製血液正常殺菌活力和白細胞吞噬活性，可使細菌生長迅速，陽性率提高。此外用溶血離心法處理血標本亦可顯著提高培養率。且提早出結果。標本采集後應盡量不接觸空氣，標本運送可采用下列方法：①針筒運送法：用於運送各種液體標本，用無菌針筒抽取標本後，排出多餘的空氣，針尖插入無菌橡皮塞、隔絕空氣，運送至實驗室;②無氧小瓶運送法：通常用以運送少量膿液，以無菌青黴素小瓶采樣，瓶內裝培養基0.5ml，加少量亞甲藍或刃天青(resazurin)作為氧化還原指示劑，加蓋密封；③大量液體標本運送法：裝滿標本瓶，即可驅除瓶中空氣，加蓋密封運送；③大量液體標本運送法：裝滿標本瓶，即可驅除瓶中空氣，加蓋密封運送;④組織塊運送法：組織塊置密閉厭氧罐中運送，罐內放入一團以酸化硫酸銅浸泡處理過的鋼絲羢以吸氧;⑤厭氧菌培養袋運送法：患者標本床旁接種於預還原厭氧滅菌培養基，然後將平板放入厭氧袋中運送。棉拭子最好勿用，如係棉簽采集的標本，應直接將之插入預還原培養基如硫乙醇酸鈉(THIO)培養基中洗出，擠幹，將洗出懸液再按上述吸出物(抽出物)接種培養基即可。

　　(2)培養：培養基於接種前必須處於無氧狀態。為達到此目的，可：①初代培養用的平板應新鮮配製，4h內用完;或放人充以二氧化碳的不透氣密封塑料袋中，4℃保存，1～2天內用完;②用前放入無氧環境，使預還原24～48h;③用預還原厭氧滅菌法配製的培養基，即在整個配製和分裝過程中均通入二氧化碳，使培養基不接觸氧;④液體培養基使用前煮沸10mm。驅除溶解其中的氧氣，迅速冷卻後立即接種。非選擇性培養基：目前最常用者為牛心腦浸出液和布氏菌肉湯兩種基礎培養基，加入氯化血紅素5μ/ml、維生素K110μg/ml、0.5%酵母浸出液、5%～10%羊血等製成血平皿，分別為BHIB和BRU，幾能培養出所有厭氧菌。原上海醫科大學與上海生物製品研究所合作試製的厭氧菌幹燥培養基，經廣泛應用，效果良好。選擇性培養基：利用選擇性培養基，可在眾多的細菌中，選出主要的致病菌，可根據標本的來源，選擇相應的培養基。目前常用的選擇性培養基有：①卡那黴素-萬古黴素溶血平皿(KVLB)。可抑製多數兼性厭氧菌，使產黑素普氏菌早期形成黑色素;如用於選擇卟啉單胞菌屬，萬古黴素的濃度以2ng/ml或以下為宜(原配方中的濃度為7.5ng/m1);②類杆菌膽汁七葉苷瓊脂(BBE)，脆弱類杆菌組細菌和死亡梭杆菌能耐膽汁，並能水解七葉靈，使培養基呈黑色，菌落周圍有黑暈;③卵黃瓊脂(EYA)，用於選擇產氣莢膜梭菌;④苯乙醇血瓊脂(PEA)，抑製變形杆菌和其他腸杆菌科細菌，有利於厭氧菌的生長;⑤環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(CCFA)，選擇艱難梭菌;⑥改良Fm培養基，選擇梭杆菌;⑦乳酸鈉培養基，選擇韋榮球菌等。在標本接種前，如能先進行直接塗片染色鏡檢，以了解細菌的形態和染色性，初步估計標本中的可能細菌，再選用培養基將更具針對性。厭氧菌中的放線菌屬、雙歧杆菌屬、乳杆菌屬和消化鏈球菌屬等都有不少菌種或菌株為微需氧菌，通過用同一菌落分別在有氧、無氧或5%～10%二氧化碳環境中進行培養的耐氧試驗(aerotolerance test)，可測出各種細菌對氧的需求，而命名為需氧、厭氧、微需氧等不同類型的細菌。厭氧菌接種後應放入厭氧培養裝置和儀器以維持厭氧環境。目前臨床常用的厭氧培養裝置有厭氧培養罐(anaerobic jar)，或厭氧缸、厭氧袋和厭氧箱或厭氧室(chamber)三種係統，三者對臨床常見厭氧菌的檢出率基本相同，但以厭氧培養罐最簡便實用，厭氧培養罐可用泵抽氣充氣或化學方法去除操作環境中的遊離氧，而以N2(80%)，CO2(10%)、H2(10%)取代，建立厭氧環境。H2在催化劑(氧化鈀)存在的情況下，可與殘留的氧化合而形成水。罐中可放亞甲藍作指示劑。接種後的培養基置厭氧環境中孵育，48h後進行初次檢查。如無生長繼續孵育，同時再接種一平皿進行孵育，兩者均無生長者作為陰性，故培養一般需1周以上才能作出結論。

　　(3)鑒定：厭氧菌的常規鑒定包括菌落形態、溶血性、色素產生、經紫外線照射有無熒光現象、菌落塗片、染色和鏡檢、生化反應、動力、毒力試驗等;其中糖發酵試驗為基本的生化反應，常規采用試管法，培養基用量大，需時長，目前已發展微量、快速、商品化的鑒定係統。國外有專供厭氧菌鑒定的多種檢測係統和快速鑒定係統，使厭氧菌的鑒定標準化，並可與微機聯用逐步自動化。已有下列幾種鑒定係統：①推斷性平皿(presumpto plates)：是由美國CDC實驗室Lombard與Dowell兩學者設計製成，故亦稱LD瓊脂，乃將多種試驗集合製成專門比的平皿培養基，稱為推斷性平皿(pp)，pp共有pp1、pp2、pp3三種。每一種平皿劃分為四個區、三個平皿共12個區(包括pp1的LD瓊脂和七葉苷、卵黃與膽汁，pp2的DNA、葡萄糖、牛乳與澱粉。以及pp3的甘露醇、乳糖、鼠李糖與明膠等瓊脂)可測定厭氧菌的18種不同特性。純培養接種於pp後需在厭氧環境下孵育48h後觀察結果，對照厭氧菌的分類特征，和該商品所提供的鑒定表格可作出推斷性鑒定。②生化微量鑒定係統(biochemical-based minisystem)：其所進行的試驗與常規檢驗係統測試者大多相同。但製成小形塑料條或盤。例如APl20A即為一塑料長盒，內有20個，內置試劑用以檢測細菌的吲哚生成、觸酶、尿素酶、七葉苷水解、明膠液化和對16種糖的發酵活力;使用本係統時，細菌混懸液加入內後需置厭氧環境中孵育24～48h，觀察結果，讀數可查對生產者提供的電碼本。③細菌已形成酶活性的微量鑒定係統(pre-existing enzyme-based minisystem)，采用小形塑料板或卡。細菌已形成的酶與微量基質(酶作用物)作用後能發生迅速反應，菌液加入板上的內後無須置厭氧環境孵育，4h即可觀察結果，已有AN-IDENT(21種試驗)、Rapid ANAAⅡ(18種試驗)、Microscan(24種試驗)等係統生產。

　　2.氣相色譜分析主要包括細菌代謝產物和細胞成分的分析。

　　(1)厭氧菌代謝產物的氣相色譜分析：厭氧菌的特點之一為代謝過程中產生各種揮發性和非揮發性短鏈脂肪酸以及醇類產物。不同菌屬與菌種所產生脂肪酸、醇的種類和數量不同，因此可用氣相色譜分析鑒定。厭氧菌產生的揮發性脂肪酸有醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸等;非揮發性脂肪酸有丙酮酸、乳酸、琥珀酸等，不能直接進行氣相色譜分析，必須先用甲醇或三氟乙硼等酯化，生成甲基衍生物再行氯仿提取進行氣相色譜分析。臨床標本(如膿液等)中也可有脂肪酸累積，故可以乙醚或氯仿提取製譜分析，在收到標本1h內即可作出有無厭氧菌的初步診斷，但為確診是何種厭氧菌必須作進一步鑒定。

　　(2)厭氧細胞成分的氣相色譜分析：將細菌細胞皂化釋出脂肪酸，加入甲醇甲基化後進行氣相色譜分析，鑒定結果客觀，重複性好。

　　3.免疫學檢查及其他熒光抗體技術(包括直接和間接)能成功地識別各種厭氧菌(如類杆菌、梭菌、梭形杆菌、短棒菌苗等)。臨床厭氧菌感染中，致病菌以脆弱類杆菌(Bf)最為常見。國外雖有熒光抗體商品，但價格昂貴。國內學者從分離得的Bf中，精篩出一株Bf，製備得高價免疫血清，以熒光標記後，檢測Bf，陽性率達100%，而非Bf菌熒光抗體染色均為陰性;此外亦進行了間接免疫熒光法用於診斷產氣莢膜梭菌(Cp)、Bf、產黑素普氏菌、核梭杆菌等感染的研究，並與細菌培養法比較，兩者的符合率相當高;用免疫酶標組化診斷Cp，與培養法和熒光抗體染色法的結果進行比較，三者的陽性率基本一致，有快速診斷價值;用酶標抗體直接染色快速診斷牙周病，與培養法比較，符合率在90%以上，方法簡便、實用。國內亦已開始應用Bf DNA探針於臨床，其敏感性為89.8%，特異性為97.3%。基因擴增技術亦已用於診斷研究。

上一篇：產氣莢膜梭菌

下一篇：月桂氮芯卓酮對耐藥性金黃色葡萄球菌體外抗菌活性研究