免疫血清對旋毛蟲感染性幼蟲侵入腸上皮細胞及其發育的影響

旋毛蟲成囊期幼蟲經口感染宿主後，在胃液和腸液的消化作用下，幼蟲在十二指腸自囊包內逸出，侵入十二指腸及空腸上部粘膜的多細胞內龕（intramulticellular niche）中，經29～36 h 完成4 次蛻皮後發育為成蟲[1]。小腸粘膜是旋毛蟲感染宿主後的第一道天然屏障，如大鼠初次感染旋毛蟲後有20%~30%的蟲體在感染後24 h 從腸道中排出稱為排蟲反應（wormexpulsion）或快速排蟲（rapid expulsion）[2]，而有免疫力的大鼠或小鼠再次感染後的排蟲率為74%~99%；對感染旋毛蟲的母鼠所產仔鼠（出生後14 和21 d）攻擊感染旋毛蟲後18 h的排蟲率分別達97.5%、91%[3]。因此，旋毛蟲脫囊幼蟲侵入小腸粘膜內繼續發育或是被宿主從腸道中排出，是旋毛蟲能否導致感染與致病的關鍵步驟。由於不能在體外觀察旋毛蟲幼蟲侵入腸上皮細胞或腸道排蟲反應的過程，目前關於幼蟲對腸粘膜的侵入或排出反應的機製均不完全清楚[4]。本文將旋毛蟲感染性幼蟲與HCT-8 腸上皮細胞在體外共培養，觀察旋毛蟲幼蟲排泄分泌（excretory-secretory，ES）抗原或表麵抗原（surface antigens）免疫鼠血清對幼蟲侵入腸上皮細胞及發育的影響。
　　　　1 材料
　　　　1.1 旋毛蟲、實驗動物和細胞株
　　旋毛蟲為河南省南陽豬源旋毛蟲(Trichinella spiralis)，由本室昆明小鼠傳代保種。雄性6 周齡昆明小鼠（清潔級）和雄性6 周齡BALB/c 鼠（SPF 級），體重20~25 g，均購自鄭州大學醫學院實驗動物中心。人結腸癌細胞係（human colonic carcinoma cell line-8，HCT-8）購於中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。HCT-8 細胞接種於1640 完全培養基中，37 ℃ 5% CO₂ 培養箱中培養。
　　
　　1.2 主要儀器和試劑
　　人工消化液（含1%胃蛋白酶、0.7%鹽酸和0.85%氯化鈉），1640 完全培養基含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，上海尚寶公司生物科技有限公司）、100 U/ml 青黴素和100 μg/ml 鏈黴素，半固體培養基（含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基+1.75%低熔點瓊脂糖），FITC 標記的羊抗鼠IgG 均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。倒置顯微鏡（IX71）和熒光顯微鏡（BX51）均為日本奧林巴斯產品。
　　
　　2 方法
　　
　　2.1 肌幼蟲的收集
　　50 隻昆明小鼠經口感染旋毛蟲肌幼蟲（300 條/鼠）42 d 後拉頸處死。膈肌壓片鏡檢證實感染成功後，剝皮、除內髒和脂肪，用攪拌器攪碎小鼠骨骼肌。將肌肉與人工消化液按1g∶10 ml 混合後置於42 ℃震蕩消化4 h，按貝氏法收集肌幼蟲，生理鹽水反複洗滌後鏡下計數備用[5] 。
　　
　　2.2 ES 抗原與表麵抗原免疫血清的製備
　　ES 抗原與表麵抗原的製備分別參照文獻[6,7]操作，考馬斯亮藍測定ES 抗原和表麵抗原蛋白濃度分別為1.26 mg/ml 與0.86 mg/ml。將ES 抗原與福氏完全佐劑1：1 混合後，皮下注射免疫10 隻BALB/c 小鼠，間隔10d 後再用ES 抗原與福氏不完全佐劑1：1 混合後皮下注射免疫第2 次，間隔10 d 第3 次皮下注射免疫，於免疫後1 周尾靜脈采血，分離血清，采用ELISA 法測定血清抗體滴度，當滴度達10⁴ 以上時，於第3 次免疫後10d 皮下注射加強免疫1 次，1 周後眶竇靜脈采血，分離血清。表麵抗原免疫血清的製備方法同ES 抗原免疫血清，ES 抗原與表麵抗原每次免疫小鼠的劑量均為20μg/隻。ELISA 檢測ES 抗原、表麵抗原免疫鼠血清抗體滴度分別5×10⁵ 與1×10⁵。
　　
　　2.3 旋毛蟲肌幼蟲的激活
　　將旋毛蟲肌幼蟲用含5%牛膽汁的無菌生理鹽水在37℃ 5% CO2 條件下孵育2h，用無菌生理鹽水洗滌3 次後，加入含抗生素的生理鹽水（100 U/ml 青黴素，100 μg/ml 鏈黴素）中37 ℃孵育1 h，備用[8]。
　　
　　2.4 幼蟲在腸上皮細胞單層中發育情況的觀察
　　將 HCT-8 細胞以1×10⁶/孔的密度接種至含完全培養基的6 孔培養板中，37 ℃ 5% CO2培養24 h，鏡下觀察HCT-8 細胞貼壁生長至成致密的單細胞層。將激活後的幼蟲加入半固體培養基中，然後覆蓋到HCT-8 細胞單層，37℃ 5% CO₂ 培養，分別在12、18、24、36、72 和96 h 時鏡下觀察幼蟲的蛻皮及發育情況。
　　
　　2.5 免疫血清對幼蟲侵入腸上皮細胞及發育的影響
　　將 200μlES 抗原或表麵抗原免疫鼠血清與1800μl半固體培養基充分混合後加入約100條激活後的幼蟲，然後覆蓋到培養HCT-8 細胞的6 孔板的其中1 孔中，分別接種4 孔，37 ℃5% CO2 培養15 min，觀察幼蟲的發育情況及形態，培養36 h 後鏡下觀察並計數1 期（未蛻皮的幼蟲）及2~4 期幼蟲數（蛻皮1 次及1 次以上的幼蟲）。設感染旋毛蟲小鼠血清和正常鼠血清為對照組。
　　
　　2.6 間接熒光抗體試驗對幼蟲蛻皮情況的觀察
　　收集方法 2.5 中培養36 h 的幼蟲，采用試管法進行間接熒光抗體試驗（IFAT）[9]，即將收集的幼蟲置於1.5 ml 離心管中，加入1 ml 冷丙酮固定10 min；加入表麵抗原免疫鼠血清（用0.01 mol/L pH 8.0 的PBS 1：10 稀釋），37 ℃孵育30 min、PBS 洗滌3 次；加入用0.01mol/L pH 8.0 的PBS 1：30 稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG，並加入0.01%的伊文思藍，37 ℃孵育30 min、PBS 洗滌3 次；將幼蟲轉移至載玻片上，滴加一滴緩衝甘油，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察。蛻皮的幼蟲無綠色熒光或僅有微弱的熒光，未蛻皮幼蟲顯示明亮的綠色熒光，分別計數1 期及2~4 期幼蟲數。設旋毛蟲感染小鼠陽性血清對照、正常小鼠血清陰性對照和PBS 空白對照。
　　
　　2.7 統計學分析
　　采用 SPSS16.0 對實驗數據進行處理，旋毛蟲幼蟲數用均數±標準差表示。應用卡方檢驗對數據進行分析。
　　
　　3 結果
　　
　　3.1 幼蟲在腸上皮細胞單層中的發育情況
　　培養 12 h 時旋毛蟲幼蟲已侵入HCT-8 細胞單層並在其中移行；18 h 在幼蟲尾端可見鞘的形成，頭端未發現帽樣結構；24 h 可見幼蟲部分蛻皮；36 h 幼蟲蛻皮1 次；72 h 可見幼蟲第2 次蛻皮；96 h 可見到早期成蟲，在雄成蟲尾端能夠看到交配附器。
　　
　　3.2 免疫血清對幼蟲侵入腸上皮細胞的影響
　　旋毛蟲幼蟲在含ES 抗原或表麵抗原免疫血清的半固體培養基+HCT-8 細胞培養15 min後，發現ES 免疫血清組的部分幼蟲頭端有帽樣結構形成，旋毛蟲感染小鼠血清對照組部分幼蟲頭端也有帽樣結構；帽樣結構與幼蟲頭端緊密相連。表麵抗原免疫血清組、正常小鼠血清對照組的幼蟲均未觀察到帽樣結構。少數帶有頭端帽樣結構的幼蟲可移行到細胞單層表麵，多數仍停留在半固體培養基中，但均不能侵入HCT-8 細胞單層中。培養12 h~36h 時可見蟲體的尾端或者頭端脫鞘，但蟲體不能從鞘中脫出。
　　
　　3.3 免疫血清對幼蟲發育的影響
　　由於旋毛蟲幼蟲表麵抗原具有期特異性，蛻皮的幼蟲無綠色熒光或僅有微弱的熒光，未蛻皮幼蟲則顯示明亮的綠色熒光。幼蟲在含4 種血清的半固體培養基+HCT-8 細胞中發育至2~4 期幼蟲百分比的差異有統計學意義（χ2=178.3，P<0.05），在含旋毛蟲感染鼠血清、ES 抗原及表麵抗原免疫鼠血清條件下發育至2-4 期幼蟲的百分比分別為1.17%、2.25%、2.2%，均低於含正常鼠血清條件下24.74%的百分比（χ12=77.6，χ22=74.6，χ32=66.9，P<0.05），但在感染鼠血清、ES 抗原及表麵抗原免疫鼠血清條件下發育至2-4 期幼蟲百分比的差異無統計學意義（χ2=2.14，P>0.05）。
　　
　　4 討論
　　
　　人結直腸癌細胞係-8（human coloniccarcinoma cell line-8，HCT-8），也稱為人回肓腸上皮細胞係-8（human ileocecal epithelial cell line-8），培養成熟的HCT-8 細胞形態和功能與小腸上皮細胞類似，國內外主要用於藥物吸收、結腸癌耐藥機製等研究。近年來有人將HCT-8細胞成功地用於腸道內寄生原蟲-隱孢子蟲的體外培養[10-11]及抗隱孢子蟲藥物的體外篩選[12]。本文模擬旋毛蟲感染宿主後的腸道內環境，觀察旋毛蟲幼蟲在HCT-8 細胞中的發育情況,結果表明HCT-8 細胞能夠維持旋毛蟲幼蟲在體外的發育，可作為體外研究旋毛蟲侵入機製及篩選抗旋毛蟲藥物的細胞係。
　　感染性幼蟲在含感染鼠血清或ES 抗原免疫血清的培養基中培養15 min 後，發現部分幼蟲頭端有帽樣結構形成，表明幼蟲頭端的帽樣結構是由幼蟲口孔分泌的ES 抗原與感染血清或ES 抗原免疫血清中的抗體形成的免疫複合物，提示旋毛蟲ES 抗原中可能存在有幼蟲侵入腸上皮細胞的相關因子。由於旋毛蟲感染性幼蟲的口孔無齒狀和矛狀結構，幼蟲並不能侵入所有的細胞係（如人肺成纖維細胞WI-38、小鼠橫紋肌成肌細胞C2C12 及大鼠空腸隱窩細胞IEC-6 等）[8]，故幼蟲對腸上皮細胞的侵入可能不是簡單的機械性損傷，而可能是通過幼蟲分泌的某種蛋白或宿主細胞釋放的某些化學信號介導的[13]。本研究觀察到的帶有頭端帽樣結構的幼蟲不能侵入到細胞單層中，表明幼蟲頭端的帽樣結構可阻止幼蟲對腸上皮細胞的侵入，其機製可能與帽樣結構阻止了幼蟲感覺器官對細胞信號的接收有關[14]。McVay[15]等將針對旋毛蟲幼蟲表麵與分泌蛋白中泰威糖（tyvesole）抗原的單抗加入培養的犬腎上皮細胞MDCK-AA7 中，發現高濃度的單抗可完全阻止幼蟲對上皮細胞的侵入，而低濃度的單抗雖然不能阻止幼蟲的侵入，但可將幼蟲包裹在細胞單層中，阻止幼蟲的移行與蛻皮[16]。本研究將ES 抗原及表麵抗原免疫血清按1：10 加入半固體培養基+HCT-8 細胞培養36 h，發現發育至2-4 期幼蟲的百分比（2.25%及2.2%）均明顯低於含正常鼠血清條件下培養的幼蟲（24.74%），表明兩種免疫血清均可阻止部分幼蟲的蛻皮及發育。

　　
　　[參考文獻] (略)
　　

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