了解原生質體融合技術的原理。
學習並掌握以細菌為材料的原生質體融合技術。
二、實驗原理
原核微生物基因重組主要可通過轉化、轉導、接合等途徑,但有些微生物不適於采用這些途徑,從而使育種工作受到一定的限製。1978 年第三屆國際工業微生物遺傳學討論會上,有人提出微生物細胞原生質體融合這一新的基因重組手段。由於它具有許多特殊優點,所以,目前已為國內外微生物育種工作所廣泛研究和應用。
(一)、原生質體融合的優點
(1)、克服種屬間雜交的“不育性”,可以進行遠緣雜交。由於用酶解除去細胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物,皆可發生原生質體融合,產生重組子。
(2)、基因重組頻率高,重組類型多。原生質體融合時,由於聚乙二醇(PEG)起促融合的作用,使細胞相互聚集,可以提高基因重組率。原生質體融合後,兩個親株的整套基因組 (包括細胞核、細胞質)相互接觸,發生多位點的交換,從而產生各種各樣的基因組合,獲得多種類型的重組子。
(3) 可將由其他育種方法獲得的優良性狀,經原生質體融合而組合到一個菌株中。
(4) 存在著兩個以上親株同時參與融合,可形成多種性狀的融合子。
(二)、原生質體融合步驟
(1)、選擇親本 選擇兩個具有育種價值並帶有選擇性遺傳標記的菌株作為親本。
(2)、製備原生質體 經溶菌酶除去細胞壁,釋放出原生質體,並置高滲液中維持其穩定。
(3)、促融合 聚乙二醇加入到原生質體以促進融合。聚乙二醇為一種表麵活性劑,能強製性的促進原生質體融合。在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時,更能促進融合。
(4)、原生質體再生 原生質體已失去細胞壁,雖有生物活性,但在普通培養基上不生長,必須塗布在再生培養基上,使之再生。
(5)、檢出融合子 利用選擇培養基上的遺傳標記,確定是否為融合子。
(6)、融合子篩選 產生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型,前者性能不穩定,要選出性能穩定的單倍重組體,反複篩選出生產性能良好的融合子。
(三)、 原生質體再生率和融合率計算
三、實驗材料
(一)、 菌種:
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二)、 培養基(配製方法見下一頁附錄):
(1)、完全培養基(CM,液體);
(2)、完全培養基(CM,固體) 液體培養基中加入2.0%瓊脂;
(3)、基本培養基(MM);
(4)、補充基本培養基(SM) 在基本培養基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2%的純化瓊脂,75 Pa 滅菌20min;
(5)、再生補充基本培養基(SMR) 在補充基本培養基中加入0.5 mol/L 蔗糖,1.0%純化瓊脂作上層平板,2.0%純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min。
(6)、酪蛋白培養基(測蛋白酶活性用)。
(三)、 緩衝液:
(1)、 0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩衝液。
(2)、高滲緩衝液:於上述緩衝液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四)、 原生質體穩定液(SMM):
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸,調pH 6.5。
(五)、 促融合劑:
40%聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六)、 溶菌酶液:
酶粉酶活為4000 u/g,用SMM 溶液配製,終濃度為2 mg/mL,過濾除菌備用。
(七)、器皿:
養皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、台式離心機、721 比色計、細菌過濾器。
四、實驗步驟
(一)、 原生質體的製備:
1、培養枯草芽孢杆菌:
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜麵分別接一環到裝有液體完全培養基(CM)的試管中,36℃振蕩培養14 h,各取1 mL 菌液轉接入裝有20 mL 液體完全培養基的250 mL 錐形瓶中,36℃振蕩培養 3 h,使細胞生長進入對數前期,各加入25 u/mL 青黴素,使其終濃度為0.3 u/mL,繼續振蕩培養2 h。
2、收集細胞:
各取菌液10 mL,4000 r/min 離心10 min,棄上清液,將菌體懸浮於磷酸緩衝液中,離心。如此洗滌兩次,將菌體懸浮10 mL SMM 中,每mL 約含108~109 活菌為宜。
3、總菌數測定:
各取菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個平板)、傾注完全培養基,36℃培養24 h 後計數。此為未經酶處理的總菌數。
4、脫壁:
二株親本菌株各取5 mL 菌懸液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶濃度為100 ug/mL,混勻後於36℃水浴保溫處理30 min,定時取樣,鏡檢觀察原生質體形成情況,當95%以上細胞變成球狀原生質體時,用4000 r/min 離心10 min,棄上清液,用高滲緩衝液洗滌除酶,然後將原生質體懸浮於5 mL 高滲緩衝液中。立即進行剩餘菌數的測定。
5、剩餘菌數測定:
取0.5 mL 上述原生質體懸液,用無菌水稀釋,使原生質體裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL,塗布於完全培養基平板上,36℃培養24~48 h,生長出的菌落應是未被酶裂解的剩餘細胞。
計算酶處理後剩餘細胞數,並分別計算二親株的原生質體形成率。原生質體形成率=未經酶處理的總菌數一酶處理後剩餘細胞數
(二)、 原生質體再生:
用雙層培養法,先倒再生補充基本固體培養基(SMR)作底層,取0.5 mL 原生質體懸液,用SMM作適當稀釋,取10-3、10-4、10-5 稀釋液各1mL,加入底層平板培養基的中央,再倒入上層再生補充半固體培養基混勻,36℃培養48 h。分別計算二親株的原生質體的再生率,並計算其平均數。
(三)、 原生質體融合:
取兩個親本的原生質體懸液各1 mL 混合,放置5 min 後,2500 r/min 離心10 min,棄上清液。於沉澱中加入0.2 mL SMM 溶液混勻,再加入1.8 mL PEG 溶液,輕輕搖勻,置36℃水浴保溫處理2 min,2500 r/min 離心10 min,收集菌體,將沉澱充分懸浮於2 mL SMM 液中。
(四)、 檢出融合子:
取0.5 mL 融合液,用SMM 液作適當稀釋,取0.1 mL 菌液與滅菌並冷卻至50℃的再生補充基本培養基軟瓊脂中混勻,迅速傾入底層為再生補充基本培養基的平板上,36℃培養2 d,撿出融合子,轉接傳代,並進行計數,計算融合率。
(五)、 融合子的篩選:
挑選遺傳標記穩定的融合子,凡是在再生補充基本培養基平板上長出的菌落,初步認為是融合子,可接入到酪蛋白培養基平板上,再挑選蛋白酶活性高於親本的融合子。由於原生質體融合後會出現兩種情況:一種是真正的融合,即產生雜核二倍體或單倍重組體,另一種隻發生質配,而無核配,形成異核體。兩者都能在再生基本培養基平板上形成菌落,但前者穩定,而後者則不穩定。故在傳代中將會分離為親本類型。所以要獲得真正融合子,必須進行幾代的分離、純化和選擇。
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