纖維素是自然界中最豐富的可再生自然資源，它的降解是自然界碳素循環的中心環節。我國的纖維素資源極為豐富,每年農作物秸杆的產量達到5.7×108 t，約相當於我國北方草原年打草量的50倍。目前這部分資源尚未得到充分的開發和利用。瘤胃纖維分解菌可分泌纖維素酶來有效的降解纖維素，因此瘤胃纖維分解菌的研究具有極其重大的現實意義和光明的發展前景。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 樣品采集和處理
采集羊全瘤胃液,過濾後將處理的瘤胃液加抗生素（1 600單位/ml的青黴素，2 000單位/ml的鏈黴素）24 h後，抽取處理瘤胃液注入到濾紙培養基中，待濾紙崩潰後再將上清液抽取淨，後用纖維二糖液體培養基將潰爛的濾紙洗滌，將洗滌液再次注入濾紙培養基中，待濾紙潰爛。
1.1.2 濾紙處理
按蔡燕飛（2005）的方法進行處理[1]。
1.1.3 培養基
1.1.3.1 分離用主要培養基[2]
①纖維二糖液體培養基Ⅰ：NaHCO3 5.0 g/l,蛋白腖 1.0 g/l,纖維二糖 1.0 g/l,酵母浸膏 1.0 g/l, 磷酸緩衝A液165 ml/l，磷酸緩衝B液165ml/l，無細胞瘤胃液170 ml/l，蒸餾水 500 ml/l，0.1%刃天青1 ml/l，L-半胱氨酸鹽酸鹽 1.5 g/l。②纖維二糖固體培養基Ⅱ：即纖維二糖液體培養基Ⅰ中加入18 g/l的瓊脂。③濾紙培養基（g/l）：即將纖維二糖液體培養基Ⅰ中的纖維二糖去除，然後加入處理後的濾紙。
1.1.3.2 鑒定用主要培養基[4]
①澱粉瓊脂培養基：即將纖維二糖固體培養基Ⅱ中的纖維二糖去除，然後加入澱粉1.0 g/l。②半固體培養基：即將纖維二糖固體培養基Ⅱ中瓊脂量減為8 g/l。③糖或醇類發酵實驗培養基:蛋白腖 20 g/l，瓊脂15 g/l，氯化鈉 5 g/l,蒸餾水 1 000 ml/l，硫乙醇酸鈉1 g/l,1.6%溴甲酚紫 1 ml/l, 碳源 10 g/l，在本實驗中碳源為葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、半乳糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、阿拉伯糖、菊糖、鼠李糖、衛茅醇。④石蕊牛奶試驗培養基：新鮮脫脂乳 100 ml/l,石蕊酒精溶液 1 ml/l(或溴甲酚紫溶液0.1 ml/l)。⑤醋酸鉛瓊脂培養基：1.5%肉湯瓊脂 5 g/l,10%醋酸鉛溶液 3 ml/l,10% 硫代硫酸鈉溶液（新配製的）2.5 ml/l。⑥明膠液化試驗培養基：明膠 15 g/l,普通肉湯 100 ml/l。
1. 2 實驗方法
用無菌注射器將濾紙潰爛的培養基的上清液緩慢抽出棄掉，在剩餘的濾紙沉澱物中注入新鮮的纖維二糖液體培養基，搖動10 min，將濾紙上吸附的菌洗脫。
在厭氧操作箱中，將菌液洗脫液倍比稀釋，然後進行傾注培養。將其直接置入厭氧操作箱中39 ℃的厭氧培養箱內，連續培養36 h。待長出菌落後，用無菌牙簽在厭氧操作箱中挑取平皿中單個典型菌落，進行篩選，直至菌落單一典型，然後移入纖維二糖液體培養基中進行富集。最後用鑒定培養基進行鑒定。
2 實驗結果與分析
從綿羊的瘤胃中共分離出6株分解纖維素的細菌，對其中的4株菌株進行鑒定。
2.1 形態學觀察
細菌H1：表麵觀察，菌落是凸起、邊緣整齊、有規則的圓形，鏡下同心環狀，不透明，奶油白色，中間微黃，有光澤，粘稠，2～3 mm的中等大菌落。革蘭氏染色為陽性呈棒狀，菌體兩端稍尖，單個散在。
細菌H2：從培養基深層觀察，菌落是有規則的圓形，邊緣整齊；從培養基上部觀察，菌落呈雙凸鏡狀，黃色，2～3 mm中等大小菌落。革蘭氏染色為陽性球菌，成對或8個以上的長鏈組成。
細菌H3：在培養基的底部，菌落邊緣整齊，不規則，光下觀察，有熒光，灰白色，呈玻璃霧狀，菌落部位有氣泡，4～6 mm的大菌落。革蘭氏染色為陽性球菌，成對或短鏈組成，菌體兩端鈍園。
2.2 其它結果
2.2.1 纖維二糖培養基（無緩衝液）中最終pH值的鑒定結果
在纖維二糖培養基(無緩衝液)中的最終pH值平均為5.5。實驗結果顯示,實驗菌株發酵纖維二糖產酸。2.2.2 觀察菌體有無氣體產生的鑒定
細菌H3的菌落底部有氣泡。結果顯示，實驗菌株H3產生氣體。
2.2.3 生長特性的觀察
在纖維二糖液體培養基中一天內混濁，底部有白色細膩狀沉澱。3 d後，溶液變清，顏色由黃變紅，底部有大量絮狀沉澱。
2.2.4 對氧的需求
在厭氧罐中，培養基上培養的細菌無菌落生長；在厭氧培養箱中，培養基上培養的細菌有菌落生長。 實驗結果顯示，實驗菌株嚴格厭氧。
2.3 生化鑒定結果[3]（見表1、表2）
實驗菌株H2、H3在糖或醇發酵實驗中均為陰性，表明不利用或很少利用碳水化合物。實驗菌株H1在糖或醇發酵實驗中大部分均為陽性，表明利用或微弱利用碳水化合物。
2.3 討論
本實驗通過對細菌菌體及菌落的形態、大小、顏色的形態學觀察以及細菌其它特性和生化結果的測定,來判定細菌的種屬。按照1986版的《伯傑細菌鑒定手冊》（5）和《伯傑細菌鑒定手冊》第八版所示的白色瘤胃球菌的特征及特性[3]，初步鑒定實驗菌株H1為產纖維二糖梭菌；H2為黃色瘤胃球菌；H3為白色瘤胃球菌。
參考文獻
[1] 蔡燕飛, 李華興. 纖維素分解菌的篩選及鑒定[J].林產化學與工業，2005,25（2）：67-70.
[2] Hobson P N. Rumen bacteria, In J. R. Norris et al. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 3B. Academic Press, Inc. (London), Ltd., London. 1969:133-149.
[3] R．E．布坎南, N．E.吉本斯. 伯吉細菌鑒定手冊[M]. 科學技術出版社，1981:725-727.
[4] 東秀珠，蔡妙英，等.常見細菌係統鑒定手冊[M].科學出版社，2001:370-399.
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