抗生素微生物檢定包括兩種方法，即管碟法和濁度法。
測定結果經計算所得的效價，如低於估計效價的90%或高於估計效價的110%時，應調整其估計效價，重新試驗（標準曲線法除外）。
除另有規定外，本法的可信限率不得大於5%。
管碟法
本法係利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。
（一） 基本設備、用具、試驗材料及標準品
1. 基本設備
（1） 抗生素效價測定實驗室：室內應為半無菌，裝有紫外線燈，有固定的效價測定台，台麵要求水平、防震。該室應與稀釋抗生素溶液的工作室隔離，以防止空氣、地麵汙染抗生素。
（2） 超淨工作台：超淨工作台應放置在潔淨工作室或半無菌室內。
（3） 抑菌圈麵積測量分析儀：該儀器裝有微處理機，可自動測量抑菌圈麵積，並打印出統計分析的各種數據。
2. 用具
（1） 玻璃雙碟：為硬質玻璃製品，碟底內徑約90mm，碟高16~17mm，碟底麵應平，厚薄均勻無凹凸現象。新購的雙碟應按上述要求進行檢查。檢查時可將雙碟底平放在水平台上，每碟內加入2ml染料液，仔細觀察碟底反映的顏色深淺是否一致，挑選底部平的雙碟，洗淨晾幹，置高溫烘箱內140~160 ℃幹熱滅菌2小時後備用。
（2） 陶瓦圓蓋：應平，無凹凸現象。
（3） 不鏽鋼小管：外徑7.8±0.1mm，內徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差異不超過±25mg，鋼管內外壁要求光潔，管壁厚薄要一致，兩端麵要平坦光潔。
（4） 小鋼管放置器：四孔和六孔各一台。
（5） 遊標卡尺：精密度0.02mm。
（6） 滴管：管口應細長平滑，不得有缺口。
3. 試驗材料
（1） 培養基及其製備方法
以下培養基、緩衝液製備時，均以115℃滅菌30分鍾。
培養基 Ⅰ
腖 5g 磷酸氫二鉀 3g 水 1000ml 牛肉浸出粉 3g 瓊脂 15~20g
除瓊脂外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過（用紙漿減壓濾過或紗布棉花濾過），調節PH值使滅菌後為7.8~8.0或6.5~6.6，分裝，滅菌。
培養基 Ⅱ
腖 6g 酵母浸出粉 6g 瓊脂 15~20g 牛肉浸出粉 1.5g 葡萄糖 1g 水 1000ml
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節PH值使滅菌後為7.8~8.0或6.5~6.6，分裝，滅菌。
培養基 Ⅲ
腖 5g 氯化鈉 3.5g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸氫二鉀 3.68g 水 1000ml
酵母浸出粉 3g 磷酸二氫鉀 1.32g
除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節PH值使滅菌後為7.0~7.2，分裝，滅菌。
培養基 Ⅳ
腖 3g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 葡萄糖 1g 瓊脂 15~20g
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使其比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節PH值使滅菌後為6.5~6.6，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜麵。
培養基 Ⅴ
腖 6g 酵母浸出粉 2g 瓊脂 15~20g 牛肉浸出粉 2g 葡萄糖 3g 水 1000ml
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使其比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節PH值使滅菌後為7.8~8.0，分裝，滅菌。
培養基 Ⅵ
蛋白腖 7.5g 牛肉浸出粉 1.0g 葡萄糖 10.0g 酵母膏 2.0g 氯化鈉 5.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節ＰＨ值使滅菌後為6.5，分裝，滅菌。
營養瓊脂培養基
腖 10g 瓊脂 15~20g 氯化鈉 5g 肉浸液 1000ml(牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替)
除瓊脂外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，調節PH值使滅菌後為7.2～7.4，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜麵。
改良馬丁瓊脂培養基
腖 5.0g 葡萄糖 20.0g 水 1000ml 硫酸鎂 0.5g 酵母浸出粉 2.0g 磷酸氫二鉀 1.0g 瓊脂 15～20g
除葡萄糖和瓊脂外，混合上述成分，微溫溶解，調節PH值約為6.8，加入瓊脂，加熱溶化後，濾過，加入葡萄糖溶解後，搖勻，調節PH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜麵。
培養基可以采用相同成分的幹燥培養基代替，臨用時，照使用說明配製和滅菌，備用。
注意事項：①製備培養基的原材料，特別是腖、牛肉浸膏和瓊脂等對抑菌圈的大小與邊緣的清晰度有影響，故應預先進行試驗，挑選使用。②不得在操作抗生素的實驗室內配製培養基。配製培養基所用的器皿應與接觸抗生素的器皿嚴格分開，以免汙染抗生素。③培養基中的瓊脂用量要隨氣候冷暖不同而增減。一般夏季用瓊脂的量比冬季多，其用量多少以培養基的硬度適宜為度。④培養基在加熱煮沸後所蒸發的水分必須用蒸餾水補足。⑤培養基滅菌後，應放於37℃培養箱中培養24～48小時,證明無菌後方可使用。使用期限約為1個月，不宜保存過久，以免營養價值降低。⑥製成的培養基倒入雙碟內凝固後應透明，不得有沉澱。
（2） 緩衝液
磷酸鹽緩衝液（PH6.0）：取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml,濾過，
分裝，滅菌。
磷酸鹽緩衝液（PH7.0）：曲磷酸氫二鈉9.39g與磷酸二氫鉀3.5g,加水使成1000ml，
濾過，分裝，滅菌。
磷酸鹽緩衝液（PH7.8）：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，
濾過，分裝，滅菌。
[附注]配製緩衝液所用化學試劑的規格應為分析純試劑。
（3）試驗用菌種：試驗用菌種對被測定的抗生素應具有高度的敏感性，在一般培養基上能生長繁殖，易於保存，不應變異或變異性小，無致病性，具有敏銳的生化培養特性，能適合多種抗生素的檢定，最好是芽胞菌，因芽胞菌製備成懸液易於保存，不易變異，使用時間長。
①試驗用菌種的保存：衛生部藥品生物製品檢定所提供的菌種為冷凍幹燥菌種，可保存在5℃的冰箱內。以無菌操作啟開凍幹菌種，接種在普通瓊脂斜麵上，置37℃培養箱中培養20～22小時。取出放至室溫後，放入5℃冰箱中保存，即為試驗用菌種。試驗用菌種每月傳代一次，每季度平板分離一次。
②菌種的接種方法：從冰箱中取出菌種1支，放至室溫。另取新鮮製備的普通瓊脂斜麵1支（如瓊脂斜麵已幹燥無凝結水者，則不可使用），注明菌名、接種日期，與菌種斜麵一同放於預先用1‰新潔爾滅溶液擦拭過，並用紫外線燈照射30分鍾後的工作台上（或超淨工作台內）。操作人員用新潔爾滅溶液洗手，然後按無菌操作要求開始接種。先將菌種斜麵和待接種的培養基斜麵試管口上的棉花塞通過酒精燈火焰稍稍扭動一下，以免接種時不易拔出棉塞。用左手握住菌種斜麵和待接種的培養基斜麵，將試管口靠近火焰旁，右手拿接種棒後端，在火焰上將接種環燒紅約30秒鍾，然後將全部金屬棒通過火焰往返3次，用右手無名指及小指同時將菌種斜麵和待接種的培養基斜麵試管口的棉塞拔出，並將兩支試管口在火焰上通過一下，立即將接種環伸入菌種斜麵管內，先在近管壁的瓊脂培養基表麵上靠一下，使稍冷卻，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速將接種棒取出，並立即伸入到待接種的培養基斜麵管內，由下至上在培養基斜麵上輕輕曲折移動1次，取出接種棒，立即在火焰旁將原來的棉塞塞上，然後將接種棒上的殘餘細菌在火焰上燒灼，燒灼時應先將接種環離沾菌處的遠端燒灼，使其傳熱至沾菌處，待菌苔已枯焦、炭化後，才能直接燒灼，切不可直接猛火燒灼沾菌處，以防細菌濺出。接種完畢後，將細菌管置37℃培養箱內培養22～24小時（黴菌管一般置26～27℃培養箱內培養7天）。取出放冷至室溫後，放入5℃冰箱中保存。
③試驗用菌液的製備和保存
枯草芽孢杆菌懸液 取枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501或CVCC717]的營養瓊脂斜麵培養物，接種於盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在35～37℃培養7日，用革蘭氏染色法塗片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鍾，備用。
（取枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]試驗用菌種斜麵1支，按無菌操作要求加入滅菌水2ml，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種於盛有30ml普通瓊脂培養基的100ml三角瓶中，旋轉三角瓶使全部瓊脂培養基表麵被菌液浸潤，多餘的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中。將已接種的三角瓶置35～37℃的培養箱中培養7～10天，用革蘭氏染色法塗片鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，製成懸液，在65℃水浴中加熱30分鍾，即得。置5℃冰箱中保存，可使用6個月。）
短小芽孢杆菌懸液 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202或CVCC709]的營養瓊脂斜麵培養物，照上述方法製備。
金黃色葡萄球菌懸液 取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003或CVCC1882]的營養瓊脂斜麵培養物，接種於營養瓊脂斜麵上，在35～37℃培養20～22小時。臨用時，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。
（取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]試驗用菌種斜麵1支，用接種棒取培養物接種至10ml培養基Ⅲ中，接種時在靠近培養基液麵的試管壁上摩擦，使菌苔均勻混懸於液體培養基中，在35～37℃培養箱中培養16～18小時，取出，應成均勻的懸液，無菌膜及凝集沉澱，此菌液僅供當日使用。）
藤黃微球菌（藤黃八疊球菌）懸液 取藤黃微球菌[CMCC(B)28001或CVCC1600]德營養瓊脂斜麵培養物，接種於盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在26～27℃培養24小時，或采用適當方法製備的菌斜麵，用培養基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。
（取藤黃八疊球菌[CMCC(B)28001]試驗菌種斜麵1支，加入2ml培養基Ⅲ，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種於盛有30ml普通瓊脂培養基的100ml三角瓶中，旋轉三角瓶使全部瓊脂培養基表麵被菌液浸潤，多餘的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中，將已接種的三角瓶置26～27℃培養箱中培養24小時，用5ml培養基Ⅲ將菌苔洗下製成均勻的懸液。此懸液在5℃冰箱中保存可使用1個月。）
大腸杆菌懸液 取大腸杆菌[CMCC(B)44103或CVCC2801]的營養瓊脂斜麵培養物，接種於營養瓊脂斜麵上，在35～37℃培養20～22小時。臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，備用。
（1） 雙碟的製備：取直徑約90mm、高16～17mm的平底雙碟，用滅菌大口吸管
分別注入加熱融化的培養基20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平台上使凝固，作為底層。另取培養基適量加熱融化後，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入規定的試驗菌懸液適量（能得到清晰的抑菌圈為度。二劑量法標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm），充分搖勻，用滅菌大口吸管在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平台上冷卻後，在每1雙碟中以等距離均勻安置不鏽鋼小管（內徑6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm）4個（二劑量法）或6個（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。
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