分支杆菌藥物敏感性測定的幾個問題

非結核分支杆菌病的治療和藥物敏感性測定最初是模仿結核病的治療和結核分支杆菌藥敏試驗。但是,非結核分支杆菌在藥物敏感性方麵存在一些自己的特征。因此, 與結核分支杆菌藥敏試驗方法有所不同。目前對分支杆菌藥物敏感性研究尚欠深入,對其規律性認識不清， 結果不令人滿意。

　　一、分支杆菌藥物敏感性特征

　　就其對藥物敏感性而言, 非結核分支杆菌存在三個特點:(1)藥物敏感度幅度大,分布散。 結核分支杆菌野生株對利福平、 異煙肼、乙胺丁醇、鏈黴素、 氧氟沙星等的最低抑菌濃度（MIC）範圍相差僅 2～4倍,而鳥分支杆菌野生株對上述藥物的MIC範圍則有十數倍至百倍之多。這樣的結果,僅僅是從肺部感染和人類免疫缺陷病毒（HIV）的播散性感染患者分離株的測定結果。如果包括環境或無明顯症狀者僅僅是棲居的痰中分離株MIC的範圍可能更廣^{［1, 2］}。 和MIC一樣，最低殺菌濃度（MBC）也顯示同樣的特征，幅度大,分布散。 氧氟殺星和環丙殺星對鳥分支杆菌的MBC/MIC比值在1～8, 而結核分支杆菌僅為0.5～2。一些抑菌和殺菌定量指標分布散的特點，也反映在鳥分支杆菌的瓊脂固體培養基和液體培養基上，測定結果相差遠較結核分支杆菌大。在7H10瓊脂培養基和7H12液體培養基測定的結核分支杆菌對異煙肼、乙硫異煙胺、 利福平、鏈黴素、 卷曲黴素、乙胺丁醇等MIC 基本相同。 但是,在兩個培養基上測定的對鳥分支杆菌的MIC相差2～16倍之多。(2)大多數抗結核藥物對鳥分支杆菌等的活性很低。(3) 即使是有效藥物,大多數也顯示很弱的殺菌能力, 並顯示了株的差異性。這是因為它們有高MBC/MIC比值和MBC濃度往往超過血清峰值（Cmax)的緣故。 利福平對鳥分支杆菌野生株的MBC/MIC在4～64(pH6.8)和4～128(pH5.0), 顯示了株的差異。 600 mg口服利福平的最高血清濃度僅在8～12 μg/ml。

　　因此, 株依賴性和低敏感性成為包括鳥分支杆菌在內的分支杆菌藥物敏感性的特征。顯然，非結核分支杆菌的藥物敏感性測定不能套用結核分支杆菌的臨界濃度, 采取測定其敏感性程度的定量方法就成為唯一的正確選擇。

　　同時, 由於大多數藥物顯示很弱的對非結核分支杆菌的殺菌活性, 采用藥物聯合用藥是必然的。研究發現, 在聯合用藥效應上,非結核分支杆菌同樣顯示株間的差異。 因此,對於非結核分支杆菌來說, 藥物間的並用效應是株的特征, 而非藥物的屬性, 因此, 需要個體化測定聯合用藥的效應。

　　二、藥物協同作用的定量測定

　　采用聯合用藥一般是為了(1)減少出現耐藥性的可能性。(2) 增加邊緣效應藥物的抗菌活性, 特別是免疫無反應患者所需的殺菌活性。(3)降低用藥劑量, 減少毒性。(4)擴大治療範圍。(5)治療同時出現的多種感染。

　　聯合用藥是結核病化療最重要的原則, 其主要目的是為了(1)降低耐藥性出現頻率。(2)用於起始耐藥率高的地區。(3) 設計合理的短程化療。在結核病短程化療聯合用藥中,利用不同藥物對結核患者體內不同環境和不同代謝狀態異質性的菌群的各自作用設計聯合用藥是一個重要考慮。而在鳥分支杆菌等非結核分支杆菌治療中采用聯合用藥的目的有所不同,主要是利用藥物殺菌活性的相加或協同, 以克服“自然”耐藥性。因此,進行野生株的聯合用藥並用效應的個體化測定是必要的。

　　並用藥物測定的程序如下: 首先測定臨床分離株的單藥MIC， 對於高於“敏感” 切點的株,再進行2藥或多藥的並用效果測定。 其采用的藥物濃度應該是1/2, 1/4,1/8 MIC的單藥藥物濃度。 BACTEC法測定結果判定的標準是評估並用瓶內生長指數(GI)和單藥瓶內GI的商。此商值和並用藥物數的倒數相比較(1/並用藥物數)，兩藥並用時商值＜0.5, 可視作兩藥有協同作用；等於1時, 為相加；≥2時，為拮抗。

　　三、藥物後效應(PAE)

　　藥物的另一個抗菌活性是PAE。PAE是藥物短時間脈衝式作用後,除去藥物後發現細菌再生長或持續抑製的時間(天)。一般是將活菌數10倍增加作為再生長的指標，在結核分支杆菌中稱為生長延遲。PAE反映非致死性損傷, 是一介乎MIC和MBC之間的活性。機製不清, 可能(1) 藥物在細胞作用部位有限的滯留或(2)亞致死性損傷。在PAE期間, 增加了對其他藥物的脆弱性。但在測定PAE時, 應注意菌活性 和PAE。因此,一般采用Cmax和Cmax保持的時間測定PAE。結核分支杆菌的生長延遲, 成為短程化療的一個依據。但是PAE在非結核分支杆菌中作用的有關資料很少,仍待研究。

　　四、定量測定

　　由於從未接觸藥物的結核患者的分離株對藥物敏感性程度相近,並遠離Cmax。因此, 可采用一臨界藥物濃度測定野生株的敏感性或耐藥性。 臨床實驗室常規采用的絕對濃度法, 1%比例法均采用臨界藥物濃度法。但是, 鳥分支杆菌等非結核分支杆菌敏感性離散程度高, 有株依賴性。因此, 個體化定量測定其株的敏感性程度是唯一可能的選擇。 這些定量指標主要是單個藥物和並用藥物的MIC和MBC測定。MIC是在一定培養時間內可抑製 99%以上的菌生長的最低藥物濃度。測定中, 需要注意藥物失活和降解, 以期得到可信的數值。因此, 應慎用培養基和限定培養時間。美國國家實驗室標準委員會(NCCLS)規定一般細菌的藥敏測定時間是24～48 h, 緩慢生長分支杆菌是2周(7H10 瓊脂培養基)、8 d(7H12液體培養基), 快速生長分支杆菌為4 d。而結核分支杆菌是 3 周(7H10)和8天(7H12)。

　　另一個定量指標是MBC,是在24 h培養期間殺死99.9%接種菌群的最低藥物濃度。抑製商(IQ)( 平均Cmax/ 患者分離株)和強度指數(ID)(＞MIC的平均血清濃度/ 患者分離株MIC)是考核藥物治療的可能結果的另外兩個定量指標。但是, 在方法上也存在不同作者對接種量、藥物濃度和結果解釋上的不同意見。因此, 在鳥分支杆菌複合群中, 何時何株需要進行藥物敏感性測定仍有爭議。

　　1．MIC測定：藥物敏感性測定中必須關注的是在培養基製備和測定過程中藥物的失活。在不同培養基中, 因為成分和製備過程中藥物變化程度不同出現不同的MIC。如羅氏培養基測定的利福平的MIC是40 μg /ml, 而在 7H10瓊脂培養基為1 μg /ml, 在7H12液體培養基中為0.25 μg /ml。緩慢生長分支杆菌可采用類似結核分支杆菌藥物敏感性測定的固體法(瓊脂、羅氏、小川培養基和7H10瓊脂培養基)。由於在固體培養基中測定的MIC可能並非真正的藥物濃度，因此,測定的MIC很難和血清峰值濃度及其他藥代動力學指標比較。但是,可用於治療期間患者菌群敏感性變化的監測。

　　理想的MIC測定采用液體培養基的方法, 因為它可較好滿足藥物敏感性測定對藥物失活和時間的要求。因為 (1) 可1周內完成藥敏測定(瓊脂固體培養基需要2周)。(2) 藥物吸附和降解最少。(3)加入的濃度可認作是實際作用濃度。(4)測定的MIC 可與Cmax和其他藥代動力學參數比較。(5) 可測定MBC,得到MBC/MIC比值。液體培養基中測定MIC的方法有集落形成單位（CFU）計數法, 濁度法和BACTEC法。7H12 培養基中CFU計數法,是最精確的方法，是其它方法的對照標準。但費時費事, 不能推薦為臨床實驗室方法。結核分支杆菌由於呈簇狀生長,幹擾了濁度測定的精確度。大多數非結核分支杆菌如鳥分支杆菌和胞內分支杆菌培養物在培養液中呈散開的生長, 適用於濁度法。 但是, 為了能在1周內獲得結果, 采用了大菌量接種。BACTEC輻射測定的基礎是放射測定的抗結核藥物結果和CFU測定結果一致。方法簡單,但費用高。BACTEC的MIC測定是以生長指數(GI)低於100倍稀釋對照管的最低藥物濃度^［4］。

　　在BACTEC係統中,結核分支杆菌藥敏試驗中敏感/耐藥的臨界濃度是以未接觸過藥物的野生株最高MIC值確定的。臨界濃度法節省時間、費用，但不能檢出仍對化療反應良好的患者的中度敏感或中度耐藥株的中間株。因此, 多切點濃度(一般是3個濃度)則可將臨床分離株分成四類: 敏感( 其MIC 處於野生敏感株的範圍內),中度敏感( 其MIC高於在敏感野生株中發現的範圍, 但兩倍低於文獻中介紹的最低的Cmax), 耐藥( 其MIC處於 Cmax水平)和非常耐藥( 其 MIC 實質性高於Cmax)^［4］。由於化療失敗病例耐藥性改變非常迅速,同時敏感株的敏感程度離散度小，因此,在結核分支杆菌中測定中間株可能並不十分重要。一個測驗中,鳥分支杆菌對異煙肼的MIC₅₀為2.32 μg/ml, 而MIC₉₀則＞10 μg /ml。因此, 由於離散度大和株依賴性的原因, 采用某臨界藥物濃度判定鳥分支杆菌的敏感/耐藥相當困難, 需要尋找別的敏感/耐藥的標準。Isenberg 1988年提出一個假設: 患者分離株耐受性等於或高於Cmax株, 對化療無反應，而患者分離株對低於Cmax濃度敏感、可能對化療有反應，則成為敏感/耐藥標準的基礎。顯然,在標準中需要同時考慮兩個因素: 未接觸過藥物的野生株的最高MIC和血清 Cmax或組織濃度。

　　Heifets依據對藥物的敏感程度也將鳥分支杆菌分為四類: 敏感(其 MIC處於結核分支杆菌切點濃度內), 中度敏感(其 MIC 明顯低於Cmax,但在野生結核分支杆菌之上),中度耐藥( MIC處於Cmax水平上)和高度耐藥 (其MIC超過Cmax)。有關快速生長非結核分支杆菌如偶然分支杆菌、龜分支杆菌等的研究較少, Heifets等^［3］認為也應適用於鳥分支杆菌的劃分原則。

　　2．MBC：對需氧菌而言,MBC是指作用18～24 h培養期間能殺死 99.9%菌群所需的最低藥物濃度。這樣的殺菌率實際上是一主觀性指標。由於大多數藥物對鳥分支杆菌等的殺菌活性低,測定MBC並與Cmax比較, 對於估價感染治療結果尤其是免疫低下患者是重要的。MBC的測定隻有在液體培養基以CFU計數進行。因此,臨床實驗室常難以進行。

　　3．抑製商和強度指數都有助於對化療結果的預測。

　　五、藥物敏感測定結果的解釋

　　一般評價藥物活性有下列途徑: 試管內抑菌和殺菌活性測定,巨噬細胞內試管實驗, 產生體內條件的試管內模型實驗, 鼠實驗性治療和臨床驗證。 關於分支杆菌藥物敏感性測定雖然已經積累了大量的資料, 但是臨床驗證較少。應該特別注意的是大多數臨床驗證是回顧性分析, 缺乏雙盲試驗驗證。

　　美國胸科學會（ATS）在1997年提出了對一些非結核分支杆菌進行藥物敏感性測定的藥物名單及評價，詳見表1。

表1　考慮可作非結核分支杆菌敏感性測定的藥物(美國胸科學會,1997)

　　注：^*大環內酯類(甲紅黴素,阿齊黴素,羅紅黴素)　　藥物敏感性測定是為了預期和評價放療方案對非結核分支杆菌病治療的療效。 鑒於非結核分支杆菌藥物反應特點, 應切實考慮Heifets等關於分支杆菌藥物敏感性測定的雙個體化, 同時考慮患者藥代動力學和患者分離株的藥效學定量測定^［4］。實際上, 由於有關非結核分支杆菌的臨床治療往往是回顧性分析, 缺乏前瞻性嚴格的雙盲性臨床試驗研究, 特別是實驗室的敏感或耐藥測定結果和臨床療效的關係分析。因此, 我們期望任何非結核分支杆菌病的臨床研究都應該包括藥物敏感性測定和臨床療效關係的研究。

參考文獻

　　1，Heifets LB, Iseman MD ，Lindholm-Levy PJ. Ethambutol MICs and MBCs for Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother，1986，30: 927-932.

　　2，Heifets LB, Lindholm-Levy PJ，Flory MA. Bactericidal activity in vitro of various rifamycins against M.avium and M.tuberculosis. Am Rev Respir Dis，1990，141：626-630.

　　3，Heifets LB. Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections. London: CRC Press，1991.131.

　　4，Lee CN，Hefiets LB. Determination of minimal inhibitory concentration of antituberculosis drugs by radiometric and conventional methods. Am Rev Respir Dis,1987,136:349

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