【摘要】 杜鵑花(Rhododendron)的組織培養受基因型、外植體的來源、培養基種類、培養條件、生長調節物質、培養程序等諸多因素的影響，故具有一定的複雜性。文章概述了影響杜鵑花組織培養的關鍵因素：外植體種類，外植體消毒滅菌的方法，基本培養基的選擇，根的誘導方法等的國內外研究現狀，以期能給杜鵑花的組培研究帶來一些借鑒價值。
【關鍵詞】 杜鵑花; 組織培養
Abstract：Genotype, explants source, the type of media, culture conditions, growth regulators, culture procedures and other factors all have influence on the tissue culture of Rhododendron. So it has a certain complexity. In order to give some reference values to the tissue culture research,the paper reviewed the key factors influencing the tissue culture of Rhododendron at home and abroad,including the type of explants, sterilization methods to explants, choice of the basic medium, rooting and so on.
Key words：Rhododendron; Tissue culture
杜鵑花(Rhododendron)簡稱杜鵑，為杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)常綠落葉小灌木，是聞名於世的名花之一，不僅在園林中有很高的利用價值，還可入藥以治療疾病。野生杜鵑多為雜合體，種子繁殖後代發生嚴重分離，通常靠扡插繁殖，產量有了提高，但生長周期長，繁殖係數低，同時受母株材料和繁殖季節的影響，不能滿足社會需求。采用組織培養的方法進行大量快速繁殖是實現工廠化生產的有效措施。
在杜鵑離體繁殖中，試管苗的增殖與生根不僅與植株的基因型有關，還受外植體的來源、培養基種類、培養條件、生長調節物質、培養程序等諸多其它因素的影響，故對近三十年來(1975～2008)國內外杜鵑組織培養研究概況進行綜述，以期能給杜鵑花的組培研究帶來一些借鑒價值。
1 外植體種類
杜鵑花是多年生木本植物，由於多毛、多鱗片、發粘、材料大而消毒困難，因此大多數組織培養外植體取自幼嫩的組織，染菌較少，消毒容易，易於分化形成愈傷組織或直接分化成芽。通常培養杜鵑可采用的外植體有頂芽，腋芽，雌蕊，帶腋芽的嫩莖段以及嫩葉。
1975年，Anderson等[1]以杜鵑莖尖培養植株獲得成功。1999年宗憲春[2]培養毛葉杜鵑R. championae與比利時杜鵑R. hybridun采用新發幼苗新梢。2001年鍾宇[3]以不同季節的莖尖(含莖段)為材料，培養西洋杜鵑R. hybridn，結果表明，最適外植體為摘花芽後萌發的頂芽莖尖。2003年王亦菲等[4]對兩種來自比利時的高山西洋杜鵑R. britannia，R. america的莖尖進行了成功培養。2003年梁曉華等[5]對亮毛杜鵑R. microphyton的莖尖進行了培養，但成功率不高。2004年閆鳳霞等[6]選取杜鵑花R. simsii莖尖、嫩葉和老葉為外植體，誘導不定芽產生再生植株，結果表明莖尖、嫩葉效果較好。
1982年Meyer等[7]以花芽作外植體，成功培養了Nova Zembla，RoseumElegans，Sefon等品種的杜鵑。
1986年，從毛葉杜鵑R. mollicomum葉片培養得到植株[8]。1991年報道了以葉為外植體，離體條件下誘導杜鵑R.‘P.J.M. Hybride’植株再生[9]。1996年，從杜鵑R. simsii7個栽培品種Paloma，Avenir，Mme. Petrick，Aline，Flamenco，Lara和 Mme. M. DePaepe 葉片誘導植株，該試驗從葉片誘導出了不定芽，但在進行生根誘導培養時未獲得成功[10]。2003年秦靜遠等[9]從R. simsii品種“Hellmut Vogel”幼葉誘導出愈傷組織，並進一步分化為叢生苗。
1987年有報道從子房組織誘導杜鵑R. prinophyllum再生[8]。
1985年，有人培養春鵑和西鵑莖尖成功率僅4%～5%，後用種子無菌苗莖段培養獲得成功。1991年，從莖段再生杜鵑R. laetum× aurigeranum獲得成功[8]。2002年鄧百萬等[10]對比利時杜鵑的幼莖進行培養，使休眠腋芽萌發，且誘導出不定芽，並從幼葉誘導出愈傷組織。2004年，湯桂鈞等[11]以德國產高山杜鵑R. lapponicum的莖段和莖尖進行外植體誘導試驗，結果顯示，莖段誘導無菌芽效果較好。2006年朱春豔等[12]以新發莖段為外植體，研究了雲錦杜鵑R. fortunei的組培快繁技術，取得成功。2007年，羅彭等[13]以幼嫩莖段為外植體對大白杜鵑R. decorum、美容杜鵑R.calophytum、喇叭杜鵑R. discolor進行組培研究，效果較好。2008年程雪梅等[14]以馬纓杜鵑R. delavayi的種子萌發的無菌苗莖段為外植體進行研究，獲得成功。
1993年有報道從雄蕊誘導杜鵑R.‘P.J.M.’再生植株和器官發生[13]。
總結以上表明，最優良的外植體是旺盛生長季節(3月下旬到4月上旬)杜鵑新發枝的幼嫩芽[15]，這個時期外植體處於旺盛的生長狀態而且芽的苞片還未展開，將帶苞片的芽進行消毒，即使滅菌時間長一些也不會傷害到裏麵的莖尖生長點，接種後成活率高，增殖速度快，褐變程度輕。
2 外植體消毒滅菌的方法
在對三葉膠初級培養汙染的研究中發現高溫、多雨的環境易導致汙染，而且隨著植物材料年齡的增長，植物材料的健康狀況不斷惡化，組培汙染也會更加嚴重，研究認為外植體帶菌多少的順序為：腋芽<莖尖<頂點[16]。外植體的狀況、環境條件和操作過程是引起汙染的主要原因。對大多數植物來說，采用新生的或新抽的枝條，4～5月份的新葉、莖尖、枝條，汙染率可下降20%～30%。
杜鵑外植體消毒困難，腋芽，頂芽和雌蕊等幼嫩部位若消毒時間過長，容易死亡，若消毒時間縮短，則菌尤其是內源菌難以殺死。大多研究者采用自來水衝洗外植體5～30 min，飽和洗衣粉水洗5～30 min，自來水衝洗5～30 min，在無菌條件下用濃度70%酒精消毒15～30 s，無菌水衝洗1次，再用濃度0.1%HgCl2消毒5～8 min，無菌水衝洗4～10次。也有不經過70%酒精步驟，隻用HgCl2消毒的。
2003年梁曉華等用濃度10%H2O2，2%Br2，2%NaClO，0.1%HgCl2各浸泡10 min，對亮毛杜鵑進行消毒滅菌比較實驗，發現濃度0.1%HgCl2消毒滅菌效果最好。2005年邱璐等用濃度0.2%HgCl2代替0.1%HgCl2消毒2～3 min，取得較好效果。0.2%HgCl2優於0.1% HgCl2的原因在於高濃度的HgCl2能迅速殺死外植體表麵的微生物，達到迅速殺菌的作用;另外由於滅菌時間較短，僅2～3 min，消毒劑對外植體細胞的損傷小，外植體易於恢複生長。2003年，陳新平等[17]在進行R. simsii Planch組織培養研究時發現，外殺菌能力較強的升汞液(氯化汞)對杜鵑花的嫩莖具有較強的損傷，外植體材料易褐變死亡，故不宜使用。該實驗表明，采用飽和的次氯酸鈣上清液或5%的次氯酸鈉溶液滅菌，效果較好，處理時間為15～20 min。為加強滅菌效果，還可加入1%的克菌丹和0.1%的Twine-20配合使用，並且證明材料滅菌前的預處理，采用70%酒精浸泡，處理時間不超過30 s效果更好。2003年，秦靜遠采用10%的次氯酸鈉溶液進行消毒。2004年，黃萍萍[18]用5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min進行消毒。2006年， 在高山杜鵑R. Delavayi的組織培養關鍵技術研究中，首次采用把莖段先在洗衣粉液浸泡20 min，流水衝洗至清，再用1%的84消毒液振蕩15min，以達到清除汙垢，還對莖段和莖尖進行了消毒效果的比較實驗，主要比較在消毒時間及消毒條件相同的情況下，5%次氯酸鈉+0.1%的山梨糖醇浸泡15 min和0.1%升汞浸泡10 min的效果差別，結果發現，用升汞對杜鵑進行消毒，汙染率低，但會加重外植體的褐化程度，尤其是成年型外植體，褐化率可達60%以上，因此，作者建議采用5%次氯酸鈉+0.1%的山梨糖醇對外植體進行消毒(何芳蘭)。2008年，官汝淳等[19]用5%青黴素溶液浸泡10min代替0.1%HgCl2進行消毒。
總的來說，杜鵑花的新莖柔嫩度高、酚類物質含量高，處理時宜采用氧化性較低的滅菌劑類型。外植體大小對實驗有很大影響，外植體太大，給消毒滅菌帶來困難，消毒不徹底;但外植體太小，容易受消毒液損傷，難以恢複生長。消毒完後，在超淨台上將腋芽，頂芽，雌蕊，帶腋芽的嫩莖段的切口上麵被損傷的細胞切除，再進行接種。嫩葉則要去除葉脈及葉邊緣損傷細胞，然後切成適當的大小，再進行接種。
3 基本培養基的選擇
1975年Anderson等人總結出可廣泛應用於杜鵑屬組培的Anderson培養基。1985年，用Anderson培養春鵑和西鵑種子苗切段獲得成功[15]。2003年孫振元等[20]以Anderson改良的杜鵑花培養基對毛白杜鵑R. mucronatum進行組培，效果好。
1980年，木本培養基(woody plant medium，WPM)被研製出，這種培養基對培養杜鵑科的一些木本植物非常有效[15]。秦靜遠用WPM培養基誘導杜鵑的葉片，獲得再生植株。2004年，苗永美對大樹杜鵑R. protisum， 桃葉杜鵑 R.anne和銀葉杜鵑R.argyrophyllum的葉片愈傷組織誘導進行研究，得到最佳培養基為WPM(四川農業大學碩士學位論文，2004)。2006年朱春豔等以WPM為基本培養基，研究了雲錦杜鵑R. fortunei的組培快繁技術，效果好。2008年程雪梅等以WPM為培養基，成功進行馬纓杜鵑R. delavayi的組培研究，取得成功。
1984年采用Read培養基培養耐寒落葉杜鵑[15]。用Read培養基培養錦秀杜鵑R. pulchrum、映山紅R. simsii、迎紅杜鵑R. mucronulatum，成功獲得再生植株。2001年，鍾宇用這種培養基成功培養了西洋杜鵑。2003年，王亦菲等以西洋杜鵑的兩個栽培品種R. britannia和R. america為供試材料，比較MS，Anderson，Read，N6 4種基本培養基對外植體誘導的影響，研究結果表明Read培養基表現最為出色，誘導率達85%。
1986年培養春夏杜鵑R.indicum選用1/4MS[15]。2008年顧地周等[21]用1/4MS培養基為基本培養基對牛皮杜鵑R. chrysanthum進行組織培養與快速繁殖的研究。2004年，閆鳳霞等選取1/4MS型培養基來進行杜鵑花R. simsii & R. spp.的快繁生產。2004年，黃萍萍采用高山杜鵑R. delavayi莖節為初代培養的外植體， 篩選出相對較優的培養基為1/ 4MS。2007年周豔等[22]以1/4MS培養基為基本培養基，對馬纓杜鵑R. delavayi進行研究。2008年，官汝淳等培養短果杜鵑R. brachycarpum，采用的芽誘導和增殖培養基為MS，壯苗生根培養基為1/4MS，成活率達90%以上。
1999年培養毛葉杜鵑與比利時杜鵑時選用B5培養基[15]。
2002年鄧百萬用Anderson，Read，N6培養基(MS大量元素、B5培養基的維生素、MS鐵鹽、Read微量元素)為基本培養基培養比利時杜鵑，發現3種培養基均能誘導腋莖萌發、不定芽形成及愈傷組織的形成，其中以N6培養基為優，最適合比利時杜鵑生長。
2003年梁曉華以Read，Anderson，1/4MS，1/10MS對亮毛杜鵑進行比較實驗，發現在Read，Anderson，1/4MS培養基上7d後完全褐化死亡，培養在1/10MS上的植株21 d後死亡。
2003年，王荃等[23]研究東洋杜鵑花R. obtussum的合適的組織培養各因素條件。結果表明，由於杜鵑花科植物原產於高山酸性土壤，低鹽分濃度及高比值NH4+/NO3-的基本培養基K和B適合東洋杜鵑。
目前為止，培養杜鵑廣泛選用MS，Anderson的改良MS，1/4MS、Anderson和Read這5種培養基。這5種培養基在許多方麵存在差異，但主要的區別在於總鹽含量和銨態氮與硝態氮的比值。選用何種培養基，因杜鵑的種、品種及外植體而異，需要實驗來確定。
4 植物激素的選用
因培養的杜鵑種和品種差異激素的效果是不同的，因此在培養中應當仔細觀察比較，選定適宜的細胞分裂素。
6-BA和ZT在杜鵑組培中應用較多。1975年Anderson培養高山杜鵑的實驗表明6-BA有害於杜鵑的生長增殖。1981年，培養幾個杜鵑種和雜種R.cauescens， R.ChopTank， R.prounifolium， R.prounifolium×arbrescens時，發現6-BA不但抑製側芽萌發，也抑製增殖，而采用2iP時，有兩個種6周內可增值3～4倍。2001年鍾宇用ZT培養西洋杜鵑R. hybridn。2003年孫振元等用ZT培養基培養毛白杜鵑R. mucronatum，獲得成功。2003年李俊強(四川農業大學碩士學位論文，2003)用6-BA培養銀葉杜鵑R. argyrophyllum。顧地周等進行牛皮杜鵑R. chrysanthum組織培養與快速繁殖的研究時，用6-BA作為愈傷誘導和分化的激素，取得成功。陳新平在R. simsii組織培養時發現細胞分裂素以ZT的誘芽效應較為顯著。2003年王亦菲等以西洋杜鵑的兩個栽培品種R. britannia，R. america為材料探討外源激素種類對杜鵑繁殖係數的影響，結果在ZT與NAA組合上獲得了較高的繁殖係數。2003年王荃等研究東洋杜鵑花R. obtussum的合適的組織培養各因素條件，結果表明，6-BA適合東洋杜鵑。2004年，苗永美在用6-BA、KT並附加一定的生長素培養大樹杜鵑R.protistum時，發現葉片逐漸變黃死亡，最後導致材料的整體死亡，因此，認為6-BA、KT至少其中的一種對大樹杜鵑有毒害作用。2004年，閆鳳霞等進行R. simsii的快繁生產時，選取6-BA為細胞分裂素，取得較好效果。2003年梁曉華等對亮毛杜鵑R. microphyton的研究得出的結果是ZT比較適合亮毛杜鵑生長。
TDZ也被廣泛應用於杜鵑的離體培養。苗永美用TDZ誘導R. Simsii的葉片產生叢芽，但芽極短(四川農業大學碩士學位論文，2004)。在苗永美的3種杜鵑的葉片培養研究中，TDZ不僅誘導3種杜鵑葉片產生了愈傷組織，而且TDZ還誘導桃葉杜鵑和銀葉杜鵑葉片直接產生不定芽。李俊強用6-BA誘導銀葉杜鵑葉片產生了愈傷組織，發現愈傷組織不能在含有6-BA的培養基上存活，最後逐漸死亡，而在苗永美研究中發現，TDZ能很好地維持銀葉杜鵑愈傷組織的生長，且發生了再分化誘導出了不定芽，說明TDZ在使銀葉杜鵑葉片脫分化和再分化方麵要強於6-BA;同樣用6-BA也沒有從銀葉杜鵑葉片誘導出不定芽，說明TDZ具有比6-BA更高的使培養物直接分化芽的能力。2008年，程雪梅在馬纓杜鵑R. delavayi的組織培養中首先利用TDZ誘導從生芽，然後轉入含KT 的培養基使叢生芽伸長，取得較好效果。苗永美用Anderson的改良MS +TDZ + IBA(NAA)杜鵑R. spp的莖段、莖尖，1個月產生了大量叢生芽;而用6-BA、KT時，隻出現腋芽萌發，頂芽伸長，無叢生芽產生。由此看來，TDZ對誘導叢生芽很有效，但不會使芽伸長。
杜鵑組培苗成本較高 ，降低組培苗成本，是工廠化生產杜鵑組培苗的迫切需要。在細胞分裂素的選擇上，ZT和TDZ都有成功的範例，但是ZT的價格較高，所以采用TDZ更好。
5 根的誘導
杜鵑生根並不困難，當把杜鵑的莖尖培養在無細胞分裂素的培養基上，將停止增殖，並且90%的莖尖會在插入培養基的部分長出不分枝的根。
國內大多使用IBA，NAA，IAA等生長素來誘導生根。鍾宇使用IBA生根效果優於NAA，用NAA處理的嫩枝先在莖的基部生成較多的愈傷組織，甚至接觸培養基的葉片也長有大量愈傷組織，稍後從愈傷組織上長出根，數量極多，但細短，而采用IBA誘導根的小苗，根部愈傷組織少，根較壯，但數量少。以IBA、NAA共同作用的Read+NAA 2.0mg/L+IBA 2.0mg/L對R. hybridn生根效果最好。王亦菲的實驗表明，西洋杜鵑在不含激素的1/2Read(僅大量元素減半)培養基上有22%的生根率;在1/2 Read + IBA 1.0 mg/L的培養基上生根最好，達84%;而在NAA的培養基上雖有生根，但來自愈傷組織，易脫落，效果不好。秦靜遠采用WPM +IAA 1.75mg/L+活性炭0.25%生根效果較好。杜鵑組培苗生根數量隨繼代次數而增加，直到第4代達到最高，以後保持平穩，故應以第4代以後培養的枝條進行生根培養最好，均可達到100%的生根率。也有人使用Anderson或1/2 Anderson，1/3Anderson + IAA 1.0 mg/L+活性炭
2004年，毛元榮等[24]從活性炭、培養基pH值、培養條件、碳源等方麵討論了影響高山杜鵑R. delavayi生根的因素，結果表明活性炭有利於根的正常生長與發育;無瓊脂的液體培養基生根明顯快於固體培養基;培養基的pH值5.0～5.5最適合杜鵑生根;蔗糖濃度對生根率無影響，但影響小苗根的生長速率。2006年，苗永美對桃葉杜鵑組織培養技術研究時發現兩種生長素(IBA,NAA)和AC是生根的主要因子。
國內對於杜鵑的培養大多采用瓶內生根，而國外大多采用瓶外生根，瓶外生根所使用的生長素與瓶內一致。瓶外生根的主要方法是;將芽的基部在生長素中浸泡，然後栽到泥炭∶珍珠岩=2∶1(V∶V)的花盆中，放到條件適宜的環境中;或者將芽的基部在生長素中浸泡後，放到培養基中預培養1周，然後栽到泥炭∶珍珠岩=2∶1(V∶V)的花盆中，放到條件適宜的環境中。近年來，國內也開始采用瓶外生根。2006年，朱春豔等將雲錦杜鵑組培苗扡插在無土基質中,達到85%以上的瓶外生根率。
瓶外生根具有相當大的優越性，它能顯著降低組織培養的成本，簡化組織培養的工序，在煉苗移栽上有相當大的優勢，即煉苗移栽存活率高且操作簡單，但瓶外生根技術步驟有待完善。
6 其他因素對杜鵑組培的影響
暗培養能顯著降低培養材料的褐變率，其原因可能是光刺激酚類、質體醌、類黃酮等多種次生代謝物質的合成，酚類物質對外植體具有傷害作用而暗處理可抑製這些物質的合成[16]。
杜鵑喜歡酸性環境，pH值控製在5.0～5.4效果較好，超過6.0將嚴重影響杜鵑的增殖、生根及愈傷組織的形成。
在培養基中加入抗氧化劑，如維生素C、聚乙烯毗咯烷酮等，並且在接種之前用抗氧化劑浸泡外植體1～5 min，可顯著減輕外植體材料褐變。在有些植物的組織培養中，吸附劑的添加有抑製褐變的作用，其原因可能是吸附劑有效地吸附了外植體上多酚氧化酶氧化酚類物質所產生的醌類物質[15]，減輕了醌類物質對外植體的傷害。
一般在接種後1～2 h後，在三角瓶內將接種位置移動1次，也可減輕外植體的褐變。還有研究表明[15]在啟動培養初期，即接種後的3 d內每天在三角瓶內將莖尖轉移位置，前4周每周轉接一次，以後每4周轉接1次，可有效減輕外植體的褐變。
7 存在問題
通過對杜鵑花組培近幾十年的研究，已經初步建立了一套杜鵑組織培養的快繁體係，但是杜鵑花種和品種間的差別、莖葉等外植體的消毒、不定芽分化率低、優良品種生根困難、完整植株的移栽體係等問題，仍是杜鵑花組織培養中急需研究和解決的根本問題。
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