綠膿杆菌對抗生素的多重耐藥的機製研究
錄入時間:2010-11-25 9:53:57
來源：CNKI
綠膿杆菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）感染是目前各種醫院內感染中最廣泛、最嚴重的問題之一。有報道它所引起的院內感染約占10%～35%，居病原菌之首。臨床上發現，某些細菌或細胞（如某些癌細胞）對多種藥物天然耐藥，也有些在使用單一藥物時出現對多種不同類別的藥物同時耐藥，這就是所謂的多重耐藥性，即細菌或細胞同時對多種結構完全各異的藥物耐藥。PA為一種條件致病菌，毒力不強去天然具有這種多重耐藥特性，而且在某種條件下（如使用抗生素），此特性可增強，給臨床治療帶來很大困難。所以，人們試圖通過研究其耐藥機製，以尋找解決此問題的方法。
80年代以前，人們認為PA的耐藥機製主要為：①酶的形成（如β內酰胺酶等）；②靶位的改變（如青黴素結合蛋白的改變）；③膜通透性的降低。但酶的形成與靶位改變隻能形成對某一類抗生素的多重耐藥。外膜通透性的降低，使抗菌藥物不能進入菌體，與PA的多重耐藥性關係較大。但從理論上分析，即使外膜通透性降低，藥物亦可逐漸通過外膜進入菌體內並達到一定的濃度，故難以外膜的低通透性來解釋全部現象。20世紀80年代，Levy等發現，大腸杆菌質粒介導的四環素耐藥性係能量依賴性主動外排泵將四環素排至胞外的結果。主動泵出係統的提出給人們研究PA多重耐藥機製提供了一個新思路。目前發現，PA的多重耐藥性主要由於外膜的低通透性與主動泵出係統的協同作用引起，而主動泵出係統起主導作用。
外膜通透性
大多數革蘭陽性細菌有一層很厚的肽聚糖細胞壁，其機械性強且通透性高。而革蘭陰性細菌具有另外一種結構，其外膜的外葉層由特殊的脂多糖組成，其中的脂肪酸鏈均為飽和性的，且內含多個共價鍵，所以外膜的通透性差，具有非常有效的通透屏障作用，特別是對親脂性抗生素。由於細菌的生長需要從外界吸收營養物質及排出代謝產物，所以在外膜有一些穿通脂雙層結構的蛋白即微孔蛋白，它們可構成三麵體，中間形成微小通道，允許水溶性小分子通過，以進行細胞內外的物質運輸與交換。親水性化合物可通過微孔蛋白的特異親水性通道跨越外膜，而親脂性化合物則藉擴散而通過脂雙層結構。某些β內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯黴素及喹諾酮類抗生素分子不大，有強烈的親水性，估計能很快穿透膜孔道蛋白通道，故對許多革蘭陰性細菌十分敏感，而PA僅有低效率的微孔蛋白，小分子藥物穿透其微孔蛋白的速率隻有一般革蘭陰性細菌的百分之一，如Augus等發現PA的外膜通透性僅為大腸杆菌的1%～8%。PA的天然多重耐藥性顯然與此有關。但細菌的生長需要通過外膜與外界進行物質交換，若外膜的通透性過於降低，使物質交換嚴重抑製，也不利於細胞的生長，所以細菌不可能通過大幅度降低外膜的通透性以增強其耐藥性，這難以解釋PA獲得性多重耐藥的形成。另外，從理論上分析，即使細菌外膜通透性降低，藥物亦可透漸通過外膜達到平衡[1]。隻有進入胞內的藥物被降解或滅活時，外膜的低通透性才對其耐藥性產生明顯的影響，這似乎提示PA的多重耐藥是外膜低通透性與酶的協同作用的結果。但有許多新的β-內酰胺類抗生素並不誘導產酶，而它們對β-內酰胺類的抗生素仍然高度耐藥。由此可見，在PA的多重耐藥機製中，必然有其它耐藥作用參與，這就是Levy等發現的主動泵出係統。
主動泵出係統
主動泵出係統廣泛存在於革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（如大腸杆菌、PA、空腸彎曲菌等）、真菌及哺乳類細胞（如癌細胞）中[2]，在多重耐藥中起重要作用，愈來愈受到重視。
PA的主動泵出係統主要有以下三部分組成：①外膜蛋白：如OprM、OprJ、
OprN等[3，4]，形成門通道，使藥物排到菌體外。②內膜蛋白：如MexB、MexD、MexF等[5]，為主要的泵出蛋白，具有識別藥物的作用，但這種識別不具有特異性。③膜融合蛋白：如MexA、MexC、MexE等[3，4]，能連接內、外膜蛋白，與它們一起形成可能是連續的通道並開口於外膜的複合體，使藥物直接泵到菌體外。主動泵出係統運行所需能量由氫離子藥物反轉運體逆轉H+，形成H+濃度差而產生的勢能所提供。
PA具有複雜的多重耐藥係統，而且同一耐藥突株可能同時存在著多個耐藥係統。目前研究較多的是分別由MexAB-OprM[6]、Mexcd-O-prJ[7]和MexEF-OprN[8]操縱子基因所表達的主動泵出係統。這三個操縱子具有高度的同源性，其中，MexAB-OprM廣泛存在於野生菌株中，與外膜低通透性一起決定了該菌天然的多重耐藥性。在各種誘導因素（如應用抗生素）的作用下，操縱子基因失去抑製而過度表達，明顯地增強了操縱子所編碼的主動泵出係統，從而形成獲得性多重耐藥。
最初由Poole等報道的基因OprK實際上編碼著OprM而並非OprK外膜蛋白。故一度命名為MexAB-OprK的操縱子已重新命名為MexAB-OprM[9]。其在生理條件下的阻遏蛋白為MexR基因所編碼的產物，MexR的突變株導致MexAB-OprM脫抑製而表達增強，從而形成獲得性耐藥。此泵出係統的作用增強與四環素、氯黴素、β-內酰胺類、大環內酯類、TMP、新生黴素等抗生素的耐藥有關[10]。Mexcd-OprJ和MexEF-OprN操縱子基因在一般的實驗條件下並不表達，即在PA的野生株中，不存在這兩種主動泵出係統，所以它們與此菌的天然多重耐藥無關。但當其過度表達時（如MexCD-O-prJ在nfxB突變株中，MexEF-OprN在nfxC突變株中），則參與PA的獲得性多重耐藥的形成。目前發現，MexCD-OprJ的表達，會使PA對喹諾酮類、大環內酯類、新黴素、四代頭孢類等抗生素的敏感性明顯降低，對四環素、氯黴素的耐藥性也稍增加。Gotoh等[11]發現表達MexC、MexD、OprJ的菌株對廣譜頭孢類抗生素的耐藥性也增加。而MexEF-OprN在nfxC中表達，會使PA對氯黴素、TMP、喹諾酮、亞胺培南等抗生素的耐藥性增加[8]。
最近發現[12]，TonB也與PA的主動泵出有關，參與PA的天然和獲得性耐藥的形成，但在多重耐藥機製中不占主導地位。TonB基因廣泛存在於革蘭陰性菌中，但在PA中較獨特。因為它所編碼的蛋白含有突出的N-末端並質膜上，C-末端伸展在周圍間隙中，在這裏經過能量活化後，可與外膜受體結合。在生理條件下，可把鐵轉運體[13]、維生素B12[13]、血紅蛋白[14]、鐵蛋白[15]等轉運到體內。最近有資料表明MexAB-OprM係統的運行部分地依賴能量偶聯蛋白TonB蛋白，也就是說在外膜門通道OprM打開時，需要Fe3+通過PA的外膜而被吸收。另外，TonB基因的缺失，會使PA對許多抗生素的敏感性增加，這與MexAB-OprM缺失的突變株相似。為研究TonB基因在PA耐藥機製中的作用及其與MexAB-OprM操縱子的關係，Zhao等[12]做了一係列實驗並發現：①四環素在K1040株（TonB缺失株）中的濃度高於PAO6609（TonB表達株）；②加入CCCP（一種能量抑製劑）後，此兩株菌體內的藥物聚集量均增加；③K880株（MexAB-OprM缺失）菌體內的藥物濃度高於K1040。④在K103株（MexAB-O-prM,MexCD-OprJ均缺失）中，若去除TonB基因，則菌體內積聚的藥物濃度最高。說明TonB與MexAB-OprM一樣為PA的另一主動泵出係統，參與PA的天然與獲得性多重耐藥的形成。另外的實驗還證明TonB的缺失，會使PA對四環素、氯黴素、喹諾酮類、大環內酯類、β-內酰胺類等抗生素的敏感性增加。TonB對MexAB-OprM和MexCD-OprJ操縱子基因所編碼的主動泵出係統有協同作用，但後者的運行並不完全依賴於它，TonB基因的缺失可能通過某些尚未了解的機製間接影響MexAB-OprM這個主動泵出係統的活性。
OprM基因產物是最近發現的另一具有主動泵出作用的蛋白，但其作用機製及其作用過程中是否需要其它膜成分的參與，目前還不清楚。Zhao等[16]在MexAB-OprM缺失的PA突變株中引入OprM，發現該菌株對喹諾酮、紅黴素、四環素、先鋒黴素的耐藥性增加；MexAB-O-prM+（MexAB基因缺失，OprM基因保留）株與MexAB--OprM-（MexAB與OprM基因都缺失）株相比，前者菌體內的抗生素濃度明顯為低，但加入能量抑製劑CCCP後，MexAB--OprM+株內抗生素的量明顯增多。說明在無MexA和MexB蛋白存在時，OprM表達蛋白可通過能量依賴的外排機製引起對一係列抗生素產生耐藥，也可能屬於主動泵出係統。但Wong等[17]在PA野生株中，通過克隆基因使OprM單獨過度表達，其MIC並沒有明顯變化。另外，在MexAB-OprM缺失的不同菌株中引起OprM後，對氯黴素的耐藥也無明顯變化。所以，OprM在耐藥機製上的作用還需進一步研究。
雖然，在多種耐藥機製中，膜通透性與主動泵出係統起重要作用，且主動泵出係統占主導地位。但具體對某一類抗生素來說，PA的耐藥機製中不一定都是主動泵出係統占重要作用。如對亞胺培南的耐藥主要由於OprD蛋白缺失引起[18]；對喹諾酮類抗生素的耐藥主要是由DNA解旋酶中gyrA基因突變引起[19]；在對氨苄西林、頭孢噻啶等抗生素的耐藥機製中酶的形成（如β-內酰胺酶）起決定性作用[20]。
有關PA的多重耐藥性，仍存在許多問題有待探索，如主動泵出係統的作用方式，OprM的耐藥機製，TonB與MexAB-OprM係統的活性的關係，各泵出係統之間的相互關係等等。另外，對PA耐藥性的防治對策方麵的研究進展較緩慢，還需深入，以便為臨床製定合理的給藥方案和開發治療PA感染的有效藥物提供有效依據。
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