酵母菌對氟康唑的敏感性及三種藥敏試驗方法的比較

【摘要】　目的　了解酵母菌對氟康唑的敏感性，並對3種抗真菌藥敏試驗方法進行比較。方法　利用紙片擴散法，微量稀釋法及濃度梯度法(Etest法)測定92株臨床分離酵母菌對氟康唑的敏感性。結果　Etest法和微量稀釋法所測酵母菌對氟康唑的總敏感率分別是73.9%和81.5%。紙片擴散法所測敏感菌，微量稀釋法全部敏感，Etest法敏感率為91%；紙片擴散法所測耐藥菌，其餘兩種方法檢測多數仍為敏感。從不同菌種來看，白念珠菌、熱帶念珠菌、假熱帶念珠菌、葡萄牙念珠菌、白吉利絲孢酵母菌及釀酒酵母菌對氟康唑全部敏感；氟康唑對克柔念珠菌及光滑念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)值均較高；近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、異常漢遜酵母菌及新型隱球菌中的部分菌株對氟康唑敏感，部分菌株為劑量依賴性敏感，未發現耐藥菌株。結論　氟康唑對除克柔念珠菌及光滑念珠菌的MIC值較高外，其餘酵母菌對氟康唑敏感性好。紙片擴散法雖簡便，但僅可用於初篩敏感菌，對抑菌環直徑≤14 mm者應進一步用微量稀釋法或Etest法測定其MIC值。

　　Comparison of three methods for fluconazole antifungal susceptibility test　Shen Dingxia, Xie Ling, Liu Mei, et al. Department of Microbiology, General Hospital of PLA, Beijing 100853

　　【Abstract】　Objectives　To study the susceptibility of yeasts to fluconazole and to compare three methods for antifungal susceptibility test.Methods　92 clinical isolates of yeasts were examined for the susceptibility to fluconazole by disk diffusion test, broth microdilution method and E test.Results　The total susceptibility rate of yeasts to fluconazole was 73.9% and 81.5% by E test and broth microdilution method respectively. Susceptible strains by disk diffusion test were all susceptible by broth microdilution method recommended by NCCLS and 91% susceptible by the E test. Those with inhibition zone diameters of ≤14mm were almost susceptible by another 2 methods. As concerned with the species, C.albicans, C.tropicalis, C.pseudotropicalis, C.lusitaniae, Trichosporon beigelii and Saccaromyces cerevisiae were all susceptible to fluconazole, their MICs≤8 μg/ml; C.krusei and Torulopsis glabrata possessed higher MICs of all≥16 μg/ml, even≥256 μg/ml. Some of Hansenula anomala, C.guilliermondii, C.parapsilosis and Cryptococcus neoformans were susceptible, and some were dose-dependent susceptible to fluconazole.Conclusions　Almost all yeasts examined are susceptible to fluconazole except C.krusei and Torulopsis glabrata. The disk diffusion test can only be used to screen sensitive strains although it is easier to be done, the MICs must be tested by broth microdilution method or E test when the inhibition zone is≤14mm.

　　【Key words】　Yeasts　　Fluconazole　　Microbial sensitivity tests

　　近年來，由於激素、免疫抑製劑及廣譜抗生素的廣泛應用，器官移植術的普遍開展，以及艾滋病病人的不斷增加，原發及繼發性免疫功能低下人群擴大，全身性真菌感染日益增多，抗真菌藥物的使用，又使真菌的耐藥現象出現^［1］。因此，開展真菌的體外藥敏試驗，指導臨床醫生合理用藥已受到越來越多的關注。

　　我們應用紙片擴散法、微量稀釋法及濃度梯度法(Etest法)分別測定並比較了92株分離自臨床標本的酵母菌對氟康唑(臨床應用最多的抗真菌藥物之一)的敏感性，現報告如下。

材料與方法

　　一、 材料

　　1.試驗菌：92株酵母菌分別來自臨床送檢的血液、腦脊液、腹膜透析液、痰和尿等標本。按常規方法和API 20C AUX，或用YBC卡經 VITEK儀器鑒定，其中包括白色念珠菌21株、熱帶念株菌13株、近平滑念珠菌9株、克柔念珠菌4株、季也蒙念珠菌8株、假熱帶念珠菌8株、葡萄牙念珠菌2株、新型隱球菌6株、光滑念珠菌12株、白吉利絲孢酵母菌3株、異常漢遜酵母菌4株及釀酒酵母菌2株。

　　2. 標準質控菌：采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的質控菌，近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258，由美國德克薩斯醫學院病理室Wanger先生惠贈。

　　3. 抗真菌藥：氟康唑標準品由中國大連輝瑞製藥有限公司提供，批號為4L334-92QCS-6,將其配製成1 280 μg/ml的水溶液，分裝後存於-60℃冰箱內，用於紙片擴散試驗及微量稀釋試驗。氟康唑紙片每片含氟康唑25 μg（空白紙片由北京天壇藥品生物製品檢定所抗生素研究室提供）。微量稀釋法所用氟康唑最大濃度為128 μg/ml，並經用生理鹽水倍比稀釋至0.125 μg/ml，共11個濃度。氟康唑Etest法試條為瑞士AB Biodisc 公司產品，藥物濃度範圍為0.016～256 μg/ml。

　　4. 培養基：RPMI 1640(含穀氨酰胺，不含碳酸氫鈉)，用嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)緩衝液調pH值為 7.0 ，過濾除菌後用於微量稀釋法中的菌液稀釋。在此RPMI 1640液中加入2%葡萄糖及1.5%瓊脂，傾倒平板，用於紙片擴散試驗。Etest法采用含酪蛋白腖的培養基，按商家提供的方法配製。

　　二、方法

　　1. 菌液製備：將受試菌在沙保弱平板上轉種兩次以保證其純度及生長力，用0.85%的鹽水製成菌懸液，並調整其濁度，除新型隱球菌濁度為1個麥氏單位，其餘酵母菌濁度為0.5麥氏單位，此菌懸液可用於紙片擴散試驗及Etest法。將以上濁度的菌懸液於血細胞計數板上計數為1×10⁶～5×10⁶菌落形成單位(CFU)/ml，經RPMI1640液體培養基稀釋1 000倍至最終濃度為1×10³～5×10³ CFU/ml，用於微量稀釋法藥敏試驗。

　　2. 紙片擴散法和Etest法：用棉棒將所製菌液均勻塗布至RPMI 1640和酪蛋白腖培養基平板上，待平板表麵幹後分別貼氟康唑紙片和Etest試條，放35℃培養。

　　3. 微量稀釋法：按照 1995年NCCLS推薦的酵母菌微量稀釋法抗真菌藥物敏感試驗參考方案^［2］進行，簡述如下：取經無菌處理的96孔U形板自第1～11孔，分別加入100 μl已稀釋的不同濃度氟康唑藥液及100 μl已製備的菌懸液，第12孔作為生長對照孔，隻加菌液而不加藥液，置35℃孵育。

　　以上3種試驗同時進行，並平行檢測兩株標準質控菌對氟康唑的敏感性。

　　4. 結果判定：新型隱球菌培養48小時，其他受試菌於培養24小時讀取結果。紙片擴散法結果記錄抑菌環直徑(mm)；微量稀釋法和Etest法終點記錄最低抑菌濃度或80％抑菌濃度（μg/ml)。

結果

　　1.紙片擴散法、微量稀釋法及Etest法：表1為紙片擴散法與其他兩種方法結果的比較，抑菌環直徑≥19 mm判為敏感，≤14 mm判為耐藥，15～18 mm判為劑量依賴性敏感(S-DD)。兩株質控菌的抑菌環直徑均≤14 mm。

表1　紙片擴散法真菌藥敏試驗與微量稀釋法及E test法的比較

　　2.微量稀釋法和Etest法：兩種方法所測質控菌的最小抑菌濃度(MIC)均為：克柔念珠菌ATCC 6258 32 μg/ml，近平滑念珠菌ATCC 22019 4 μg/ml；檢測試驗菌的結果及其比較如表2。

討論

　　多年來，研究者們致力於抗真菌藥物敏感試驗方法的研究並取得了一定成績^［3～5］。我們根據文獻［6］報道，選用25 μg氟康唑紙片來測定酵母菌對此藥的敏感性，結果是紙片擴散法敏感的菌株，微量稀釋法也全部敏感；但紙片擴散法耐藥菌中,用另外兩種方法多數仍為敏感(特別是白念珠菌)，部分呈S-DD和耐藥。因此，我們認為紙片擴散法僅可作為初

表2　微量稀釋法與Etest法真菌藥敏試驗結果的比較(株數)

　　注：S：MIC≤8 μg/ml；S-DD：MIC 16～32 μg/ml；R：MIC≥64 μg/ml篩試驗，對敏感菌作初步報告，如遇抑菌環直徑≤14 mm時, 應進一步測定其MIC值。

　　Etest法是一種新型的檢測細菌或真菌對抗菌藥物敏感性的方法，主要包括一含有連續抗菌劑梯度的試條，文獻報道該法與微量稀釋法具有良好的一致性^［5］。我們的結果也說明兩者的符合率高，隻是Etest法所測MIC值普遍略高於微量稀釋法，此與Colombo等^［5］在進行白念珠菌藥敏試驗時報告的結果一致，可能與Etest法所采用的連續抗菌劑梯度，以及橢圓抑菌環內有微小菌落存在導致終點判讀誤差所致。

　　目前NCCLS尚未確定抗真菌藥物敏感試驗結果的判讀界限，對紙片擴散法結果的判讀，我們采用Barry等^［6］的界限。最近根據藥敏試驗結果與臨床治療效果關係的觀察，Rex等^［7］提出，氟康唑對酵母菌的MIC≥64 μg/ml為耐藥；MIC在16～32 μg/ml為劑量依賴性敏感；MIC≤8 μg/ml為敏感。我們采用此標準，多數菌種對氟康唑敏感，氟康唑僅對克柔念珠菌及光滑念珠菌的MIC值較高。因此，對此兩種菌感染治療如選用氟康唑，應掌握好劑量，並注意觀察療效或改換其他抗真菌藥。

參考文獻

　　1Ghannoum MA, Rex JH, Galgiani JN. Susceptibility testing of fungi: current status of correlation of in vitro data with clinical outcome. J Clin Microbiol, 1996, 34: 489-495.

　　2National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Tentative standards. Document M27-T. Wayne Pennsylvania: NCCLS, 1995. 15: 1-22.

　　3周貴民, 謝靈. 酵母菌的藥敏測定方法學探討. 中華醫學檢驗雜誌, 1991,14:160-163.

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　　6Barry AL, Brown SD. Fluconazole disk diffusion procedure for determining susceptibility of Candida species. J Clin Microbiol, 1996, 34: 2154-2157.

　　7Rex Jh, Pfaller MA, Galgiani JN, et al. Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibililty test: conceptual frame work and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, Itraconazole and candida infections. CID, 1997, 24: 235-247.

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