中華人民共和國國家標準
公共場所茶具微生物檢驗方法大 腸 菌 群 測 定GB/T 18204.3-2000
Methods of microbiological examination for tea set in public places
- D et er m in at ion o f C ol ifo rm bacteria
1範圍
本標準規定了公共場所茶具大腸菌群的測定方法。
本標準適用於公共場所內公用茶具大腸菌群的測定。
2定義
本標準采用下列定義。
大腸菌群coliform bacteria
指一群在37`C,24 h培養能發酵乳糖、產酸、產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
該菌主要來源於人畜糞便，故以此作為糞便汙染指標來評價被檢物的衛生質量。
3儀器
3.1高壓蒸汽滅菌器。
3.2幹熱滅菌箱。
3.3培養箱:36℃士I'C。
3.4水箱。
3.5電爐。
3.6天平。
3.7滅菌平皿:直徑9 Cm,
3.8滅菌刻度吸管:1 ML，10 ML,
3.9滅菌棉拭子。
3.10滅菌剪刀。
3.11 PH計或精密PH試紙。
4培養基和試荊
4. 1乳搪膽鹽發酵培養液
4.1.1成分:蛋白腖20 g
豬 膽 鹽(或牛 、 羊 膽 鹽)5g
乳 糖10g
0.04 %嗅 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL
蒸 餾 水 1 000 mL
4.1.2製法:將蛋白脈、膽鹽及乳糖溶於蒸餾水中，調pH至7.4,加澳甲酚紫溶液，混勻，分裝到帶有倒管的試管中，每管10 mL。以115 `C高壓滅菌15 min。
注:雙 料 乳糖膽鹽發酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。
4.2伊紅美藍瓊脂
4.2.1成分:蛋白腖10g
乳 搪10 g
磷 酸 氫 二 鉀2 g
瓊脂17g
2%伊 紅 水 溶 液20mL
0. 65 %美 藍 溶 液 10 mL
蒸 餾 水1 0 00mL
4.2.2製法:將蛋白陳、磷酸鹽和瓊脂溶解於蒸餾水中，調pH至7.1，分裝到燒瓶內。121`C高壓滅菌15 min備用，臨用時加人乳糖並加熱溶化瓊脂，冷至50-55`C，加人伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。
4.3乳糖發酵管
4.3. 1成分;蛋白腖 20 g
乳糖 10g
0. 04 %澳 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL
燕 餾 水1 0 00mL
4.3.2製法:將蛋白陳及乳糖溶於水中，調pH至7.4，加人指示劑，分裝到帶有倒管試管中，每管3 mL,115 C高壓滅菌15 min,
4.4革蘭氏染色液
4.4.1結晶紫染色液:
結 晶 紫1g
95 %乙 醇 20 mL
1%草 酸 錢 水 溶 液 80 mL
將 結 晶 紫溶於乙醇中，然後與草酸錢溶液混合。
4.4.2革蘭氏碘液:
碘 1g
碘 化 鉀 2g
蒸 餾 水 300m1
將 碘 與 碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300mL,
4.4.3脫色液:
95 %乙 醇
4.4.4沙黃複染液:
沙 黃 0.25g
95 %乙 醇 10 mL
蒸 餾 水 90 mL
將 沙 黃 溶解於乙醇中，然後用蒸餾水稀釋。
4.5染色法
4.5.1將塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1 min，水洗。
4.5.2滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。
4.5.3滴加95%乙醇脫色，約30 s，水洗。
4. 5.4滴加複染液，複染1 min，水洗，待幹，鏡檢。
4.6染色結果
革 蘭 氏 陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
4.7大腸菌群快速檢驗紙片
4.7.1質量要求:紙片必須符合食(飲)具用大腸菌群快速檢驗紙片質量標準。
4.7.2質量標準:每張紙片5 cmX5 cm,pH值7. 0-7.4，包裝無菌，生產廠家經衛生部門審核認可。
5檢驗程序
大腸菌群檢驗程序如下:
6操作步驟
6.1采樣方法
6.1.1隨機法:隨機抽取清洗消毒後準備使用的茶具
6.1.2塗抹法:使用測定細菌總數時采集的樣品，無需重采。
6.1.3紙片法:用滅菌生理鹽水濕潤5 cmX5 cm大腸菌群快速測定紙片兩張，分別粘貼在茶具內、外緣口唇接觸處，約30 s後取下，置於無菌塑料袋內。
6.2檢驗方法
6.2.1發酵法
6.2.1.1用測定細菌總數剩餘的檢樣，倒人雙料乳糖膽鹽發酵培養液中。置36℃±1'C培養箱內培養24 h,
6.2.1.2觀察是否產酸、產氣，若有變黃和氣體產生，該管推測性檢驗陽性。
6.2.1.3如不產酸、不產氣則為大腸菌群陰性。
6.2.1.4自推測性檢驗陽性管中取一接種環培養液，轉種伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1'C培養箱培養18-24 h，然後取出，觀察菌落形態，並做革蘭氏染色和證實性試驗。
6.2.1.5在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行染色鏡檢;同時接種乳糖發酵管，置36℃±1'C培養24 h。
6.2.2紙片法
將 已 采 樣的紙片置36℃士1'C培養箱內培養16^-18h，觀察結果。
7結果報告
7.1發酵法
凡 乳 糖 發酵管最終產酸產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽胞杆菌，即可報告檢出大腸菌群。
7.2紙片法
紙 片 保 持紫藍色不變，則報告為大腸菌群陰性;紙片變黃，並在黃色背景上呈現紅色斑點或片狀紅暈，則報告檢出大腸菌群。
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