【摘要】 目的 研究臨床分離的腸球菌對常用抗生素的耐藥性及腸球菌與感染性疾病的關係。方法 應用紙片擴散法檢測從臨床標本中分離的311株腸球菌的耐藥性；脈衝場凝膠電泳（PFGE）對細菌分型；病例回顧性分析。結果 腸球菌對臨床常用的15種抗生素的耐藥率以萬古黴素最低；其次為氨苄西林/舒巴坦耐藥率為17.4%；亞胺硫黴素耐藥率為18.3%。糞腸球菌與屎腸球菌對抗生素的耐藥率有明顯差異。應用PFGE法將糞腸球菌分為A型及亞型、B型、C型及亞型、D型，屎腸球菌分為A、B、C型。結論 腸球菌對臨床常用的15種抗生素的敏感性以萬古黴素最敏感。腸球菌引起的不同係統感染，以泌尿係統最常見。PFGE對腸球菌感染流行監測是一個有力的工具。
【Abstract】 Objective To study Infections of Enterococcus spp and its resistance to antibiotics in 4 general hospitals.Methods Enterococcus resistance was tested using K-B methods. Organisms were indentified by API system and PFGE. The relationship between Enterococcus and infectious diseases was analysed according to clinical case.Results The resistant rate of Enterococcus against vanomycin was
【Key words】 Enterococcus Drug resistance, microbal Electrophoresis
腸球菌屬是人體嚴重感染的病原菌之一，可引起人體多係統感染性疾病。對免疫力低下者可致嚴重感染，如心內膜炎、菌血症等。腸球菌感染的疾病逐年增加，在引起醫院內感染因素中占第四位［1］。由於腸球菌對抗生素的耐藥性增加，以及產β-內酰胺酶的腸球菌及耐高濃度氨基糖甙類抗生素腸球菌的出現，特別是近年出現的耐萬古黴素的腸球菌給臨床治療造成困難，因此引起廣泛重視。我們研究了腸球菌對常用抗生素的耐藥性及腸球菌與感染性疾病的關係。
材料和方法
一、材料
1.菌株：(1)實驗用臨床菌株：實驗所用菌株是1995年11月至1996年11月由北京醫科大學第一醫院、積水潭醫院、北京醫院、人民醫院(分別以A、B、C、D表示)血、尿、痰、咽拭子、膽汁、宮腔分泌物、胸水、腹水、腦脊液等臨床標本中分離311株腸球菌。(2)標準菌株：ATCC 25923（金黃色葡萄球菌）、ATCC 29212（糞腸球菌）購自衛生部臨床檢驗中心。
2.抗生素紙片：氨苄西林、青黴素、頭孢唑啉、丁胺卡那黴素、慶大黴素、氧氟沙星、環丙沙星、紅黴素、氟呱酸、苯唑西林、利福平、呱拉西林、氨苄西林/舒巴坦，購自中國藥品生物製品檢定所。亞胺硫黴素、萬古黴素購自BBL公司。
3.主要試劑： API-20Strep 快速鑒定試劑盒：購自bioMeireux公司；MH培養基：購自中國生物製品檢定所；Genepath Groupl Reagent Kit 購自Bid Rad 公司，批號310-0002 。
4.主要實驗儀器：(1) 低溫高速冷凍離心機HERMLE Z383K 德國BMH公司產品；(2) 多點接種儀I型，中國科學院計算機新電腦工程公司及北京醫科大學聯合生產；(3) CHEF-DRIII脈衝場凝膠電泳儀及配套設施，美國Bid-Rad產品。
二、方法
1.菌株鑒定：應用API-20 Strep鑒定係列，操作及結果判讀按試劑盒說明完成。
2.抗生素敏感實驗(紙片擴散法)：按美國臨床實驗室標準化委員會1995年版標準操作和判斷結果。
3.染色體DNA脈衝場凝膠電泳(PFGE)：按試劑盒說明進行DNA包埋瓊脂塊的製備；電泳的選擇程序為6Enc,
結果判斷標準［2］：(1)酶切後圖譜完全一致定為同一型如A型。(2)酶切後圖譜與A型比較有1～3條帶不同者，定為亞型(如A1.....An)。(3)酶切後圖譜與A型比較如有3條以上帶不同者則定為另一基因型如B、C、D型等。
4.統計學分析：列聯表確切概率法，在SAS統計軟件包上完成。
結果
1.四家綜合醫院腸球菌屬分布情況：在311株腸球菌中，糞腸球菌占68.5%，屎腸球菌占21.9%，卡氏腸球菌5.1%，堅韌腸球菌占2.3％，鳥腸球菌占2.3%。
2.腸球菌屬對抗生素耐藥百分率：見附表。
附表 311株腸球菌對15種常用抗生素
的中介度及耐藥率(%)
|
抗生素 |
糞腸球菌 (213) |
屎腸球菌 (68) |
三種腸球菌* (30) | |||
|
I |
R |
I |
R |
I |
R | |
|
青黴素 |
0.0 |
3.8 |
0.0 |
86.8 |
0.0 |
46.7 |
|
紅黴素 |
17.0 |
72.7 |
2.8 |
89.9 |
16.7 |
70.0 |
|
慶大黴素 |
5.6 |
87.4 |
1.5 |
94.1 |
13.3 |
80.0 |
|
呱拉西林 |
22.1 |
2.8 |
10.3 |
76.5 |
23.3 |
50.0 |
|
丁胺卡那 黴素 |
0.5 |
94.8 |
0.0 |
98.5 |
0.0 |
96.7 |
|
氨苄西林 |
0.0 |
2.8 |
0.0 |
70.6 |
0.0 |
40.0 |
|
氟呱酸 |
0.0 |
80.3 |
0.0 |
92.6 |
0.0 |
80.0 |
|
氧氟沙星 |
29.1 |
52.1 |
1.5 |
91.1 |
10.0 |
73.3 |
|
利福平 |
13.1 |
79.4 |
1.5 |
89.7 |
13.3 |
73.4 |
|
頭孢唑林 |
14.1 |
79.8 |
1.5 |
89.7 |
10.0 |
76.7 |
|
苯唑西林 |
0.0 |
100.0 |
0.0 |
100.0 |
0.0 |
100.0 |
|
萬古黴素 |
18.7 |
0.0 |
5.8 |
0.0 |
6.7 |
0.0 |
|
環丙沙星 |
45.1 |
18.3 |
19.1 |
63.2 |
26.7 |
40.0 |
|
亞胺硫黴素 |
0.0 |
1.9 |
0.0 |
61.8 |
0.0 |
36.7 |
|
氨苄西林/ 舒巴坦 |
0.0 |
8.0 |
0.0 |
44.1 |
0.0 |
23.3 |
*包括卡氏腸球菌、堅韌腸球菌、鳥腸球菌；I：中介度，R：耐藥
3.腸球菌引起感染性疾病的情況：通過對病曆完整的110例住院患者分析，腸球菌引起的不同部位感染以泌尿係統感染最常見47例，占42.3% ，外科骨折術後感染次之17例，占15 .3%；肺部感染第三位10例，占9%。
4.PFGE法：結果見附圖，12株糞腸球菌DNA經SmaⅠ酶切後PFGE電泳，分為A、B、C、D型及亞型，其中1號、2號菌株均為A6型，15號16號菌株為C1亞型，相互間具有同源性。其餘菌株間無明顯同源性。4株屎腸球菌DNA經SmaⅠ酶切後PFG電泳被分為A、B、C型，其中4號5號菌株均為A型，相互間具有同源性，其餘無明顯同源性。
糞腸球菌：1、2：A6型；3：D型；6：C2型；9：A1型；
10：A2型；11：A3型；12：A4型；13：A5型；14：B型；
15、16：C1型。屎腸球菌：4、5：A型；7：B型；8：C型
酶切後PFGE電泳Ⅰ M：Lambda ladders；
附圖 腸球菌DNA SmaⅠ
討論
1.腸球菌對常用抗生素耐藥性分析：紙片擴散法藥敏實驗未篩選出耐萬古黴素的腸球菌，對萬古黴素中介度菌株占14.8% ，MIC法檢測未發現耐藥菌株。糞腸球菌對亞胺硫黴素耐藥率僅為1.9％，其次是氨苄西林。
本次試驗結果表明屎腸球菌耐藥性高於糞腸球菌，特別是對β-內酰胺類抗生素的耐藥性高。Goudron等［3］實驗證明糞腸球菌和屎腸球菌的藥物敏感性明顯不同，表現為屎腸球菌對β-內酰胺類抗生素及氨基糖甙類抗生素的耐藥性高。其耐藥機理是因屎腸球菌能產生6′-乙酰轉移酶，該酶對抗卡那黴素、妥布黴素、乙基西梭黴素［4］。由於腸球菌屬中各種菌對抗生素的耐藥性有差異，因此臨床細菌鑒定腸球菌屬應到種的水平，以便指導臨床合理選用抗生素。
本實驗未發現耐萬古黴素的腸球菌，僅有少數腸球菌處於中介度。耐萬古黴素的腸球菌在國外報道較多，可能由於萬古黴素及Teicoplanin、頭孢他啶在歐洲廣泛應用而引起耐藥菌株的出現［5］，國家醫院感染監測係統報告，腸球菌對萬古黴素的耐藥率從1989年的0.3%增加到1993年的7.9%，在美國已從1989年的0.8%增加到1993年的13.3%［6］，而國內萬古黴素耐藥菌較少，這可能與萬古黴素的使用較少有關，值得警惕的是本次實驗發現國內腸球菌對萬古黴素存在中介度菌株14.8%，這一潛在因素可能將導致耐萬古黴素的腸球菌的出現。所以要密切關注耐萬古黴素的腸球菌的流行和播散。
2.腸球菌引起的不同部位的感染 ：本試驗結果研究表明腸球菌可以引起不同部位的感染，以泌尿係感染率最高(42.3%)，外科手術傷口感染及下呼吸道次之，分別為15.3%和9%。這三部位的感染占整個感染的66.7%。提示在醫院感染管理中應加強上述部位感染的控製和預防，才能達到有效降低醫院感染的目的。
本試驗結果與Hirose報道的外科傷口感染占第一位(15%)、泌尿係感染第二位(13%)、敗血症第三位(9%)的結果略有差異。
3.腸球菌PFGE法初步分型：為了進一步對腸球菌引起的感染進行病原學研究，我們選了同一病房留標本時間在20天內的16株引起感染疾病的腸球菌(糞腸球菌12株，屎腸球菌4株)，根據耐藥譜不同分為3組：(1)對頭孢唑林、丁胺卡那黴素、頭孢呱酮耐藥，對萬古黴素敏感的共12株；(2)對氨苄西林、青黴素、亞胺硫黴素、呱拉西林、頭孢唑林、丁胺卡那黴素、頭孢呱酮耐藥，對萬古黴素敏感的3株；(3)對上述抗生素完全敏感的1株，應用PFGE法進行分析：12株糞腸球菌(根據病曆資料其中2株為院內感染菌)分成4型及亞型(A1、A2、A3、A4、A5、A6、B、C1、C2、D)。屎腸球菌4株分成3型(A、B、C)。
4.臨床病例分析：通過PFGE法進行流行病學分析：1995年12月中、下旬A院內七病房發生了A6型糞腸球菌引起院內感染散發流行，2例患者其中一例年齡為76歲，患急性心肌梗塞；另一例80歲，患帕金森病，由該菌引起肺部感染，曾用環丙沙星、亞胺培南、氨苄西林/舒巴坦抗炎治療，但終因全身衰竭死亡。
9月底婦產科病房發生了C1型糞腸球菌的散發流行，該菌導致一例產婦宮腔感染，另一例慢性盆腔炎患者泌尿係感染，兩者用滅滴靈、氟呱酸、呋喃坦丁、青黴素治療好轉。
B院1996年6月中旬，內科病房發生了屎腸球菌A型感染的散發流行，該菌導致一個患者發生泌尿係感染，用亞胺硫黴素、氨苄西林/舒巴坦治愈；另一例患者肺部感染，用氨苄西林、頭孢呱酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸治療好轉。
總之，腸球菌屬因其固有的和獲得性的多重耐藥性，是目前臨床遇到的棘手問題，對其耐藥機製的研究能更好地指導臨床使用抗生素有效地控製其感染。PFGE法對感染性疾病病原菌的流行病監測是一個有力的工具。
參考文獻
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