一種改進的三糖鐵尿素培養基

【摘要】  將雙糖培養基改進為三糖鐵尿素斜麵培養基，易於尿素酶陽性菌的結果觀察。方法 在雙糖培養基基礎上再加入2%尿素，0.2% KH2PO4，1%蔗糖製成三糖鐵尿素培養基。結果經改進後的三糖鐵尿素培養基與相關的目的菌進行性能測定試驗後的反應符合要求。結論 改進後的培養基易於尿素酶陽性菌的觀察，可以減少單管試驗。配製方法簡便易行、省時省力，尤其適用於基層實驗室工作。

【關鍵詞】  雙糖 尿素 培養基

    【Abstract】  Objective   To quickly detect the intestinal bacteria. Methods  The agar media of triple sugar iron (TSI) was made from 2% of urea, 0.2% of KH2PO4 and 1% of sucrose on the double sugar agar and tested for its function by using the related bacteria.Results  The target bacteria were successfully cultured by using TSI agar.Conclusion  The modified culture medium is fit to observe masculine fungi of urease and can reduce the single-valve experiment. The configuration method is easy, timesaving and laborsaving, especially suitable for the basic laboratory.

    【Key words】  Double sugar iron; urea; culture medium

    為了能簡便快速的鑒定出腸道致病菌，以滿足基層實驗室的需求，我們根據現有的雙糖鐵瓊脂培養基進行改良配製後，選用各不同生化反應的腸杆菌科的目的菌株對改進後的培養基進行了性能測定，證明效果尚佳，現將方法介紹如下。

    1  材料與方法

    1.1  材料來源

    1.1.1  基礎培養基  雙糖鐵瓊脂培養基（上、下層），購於杭州微生物試劑廠。三糖鐵瓊脂，購於杭州微生物試劑廠。尿素；KH2PO4均購於西安化學試劑廠。

    1.1.2  待檢菌株  誌賀菌 (1.1869)；由GGMCC提供，沙門菌（1.1174）；由GGMCC提供，地方株：宋內誌賀菌株，菌號：05002；傷寒沙門菌株，菌號：04010；腸炎沙門菌株，菌號：05007；大腸埃希菌（ETEC O78:K80，）菌號：05008；普通變形杆菌，菌號：07016；弗勞地枸櫞酸杆菌，菌號：040011，以上菌株均由本室保存。

    1.1.3  診斷血清  誌賀菌屬診斷血清（48種）；沙門菌屬診斷血清（59種）；腸致病性大腸埃希菌診斷血清（15種）以上各屬血清均由衛生部蘭州生物製品研究所提供。腸侵襲性、產毒性大腸埃希菌診斷血清（16種）由衛生部成都生物製品研究所提供。以上各屬血清均在有效期限內使用。

    1.2  方法

    1.2.1  三糖鐵尿素培養基的配製  配製培養基用華氏小試管應清洗幹淨後加塞包裝好，經15 Pa 20min高壓滅菌後備用。將成品雙糖鐵瓊脂培養基按說明分別稱量配製上、下層後混勻，將已配好的上層培養基內加入1%的蔗糖，稍加溫溶解混勻後分裝於適量的小三角燒瓶內高壓備用。再按2%尿素、0.2% KH2PO4的量加入已稱量配好的下層培養基內，稍加溫後混勻待溫度冷卻後用NaOH校正pH至7.0。將配好的該培養基下層分裝於已高壓滅菌好的華氏小試管中約1.5～2ml直立包裝。再與上層培養基一同經10Pa 10min高壓滅菌後置冰箱保存備用。

    試驗前可將配製好的上層培養基溶解後，以無菌操作下分裝於已配製好並高壓滅菌的下層培養基管中2～2.5ml製成斜麵備用。此時的培養基即為三糖鐵尿素半固體斜麵培養基。

    1.2.2  樣品接種   將待檢目的菌進行複活後，分別劃種於S.S瓊脂平板上置37℃溫箱培養18～24h，再取配製好的三糖鐵尿素半固體斜麵培養基注明菌號後，挑取經S.S瓊脂平板上培養後的典型菌落，分別穿刺接種於上述培養基內，置37℃溫箱培養18～24h後觀察結果，各待檢菌的初步生化反應結果見表1。 表1  不同菌株在三糖鐵尿素斜麵上的反應 注：（1） K為紅色；  A為黃色；  ＋為陽性；  -為陰性；  +/- 大多時為陽性，少時為陰性；-/+ 少時為陰性，大多時為陽性；  (-) 多時為陰性；   (+) 多時為陽性；  D為不定。

    1.2.3  配製時應注意點  尿素酶極受溫度影響,高壓時溫度過高過久，都有可能使尿素酶分解，如加熱不足，又可造成滅菌不徹底，所以準確的把握滅菌溫度及加熱時間是關鍵。

    加入適量的KH2PO4後，能阻止尿素在滅菌過程中產生的氨與二氧化碳聯結為氨基甲酸銨，同時KH2PO4還可起到緩衝作用，如果溫度掌握適中可使下層培養基pH保持在7.0～7.1，加入KH2PO4後，可發揮尿素酶的最大活力，易於尿素酶陽性菌的結果觀察。

    我們將改進後的培養基經過實驗後的反應歸納有以下幾種：斜麵不變色、底層變黃色，不產氣、無動力，硫化氫陰性，不分解尿素酶者可考慮為誌賀菌屬細菌；

    斜麵不變色、底層產酸產氣、產生硫化氫，不分解尿素酶者可考慮為沙門菌屬細菌；

    斜麵不變色，底層產酸不產氣，尿素酶陰性、可產生少量硫化氫者可考慮傷寒沙門菌；

    斜麵和底層均變紅色，有動力，產或不產氣，硫化氫陽性或陰性，尿素酶陽性者可考慮為變形杆菌屬細菌。

    根據以上各生化反應，能初步判斷所屬的屬或種，然後再以血清學試驗加以證實確定屬或種，同時還可以從以上生化試驗中判定出無診斷血清的其它菌屬［1］。

    3  討論

    細菌檢驗需要經過分離、培養、繁殖、動態觀察以及生化特性的不固定變化等因素綜合判定並認真鑒定後才能拿到確定的菌株，與其他檢驗醫學方麵最大的不同也在於此, 至今仍離不開傳統的手工操作。改進後的三糖鐵尿素半固體斜麵培養基與其他腸杆菌科培養基最大的優點是易於觀察尿素酶的結果，可以不做其他輔助生化。在一支培養基中，同時觀察多種生化反應和生長情況，可以防止尿素酶陽性的細菌漏檢。用於腸道菌檢查用的單糖，雙糖、三糖、四糖等培養基配製方法很多［2］，但由於配製耗時和基層實驗室在配製中的諸多問題，以致在許多基層實驗室不能正常使用。市場上出售的雙糖鐵（kligler）和三糖鐵（TS1）瓊脂培養基幹粉成品［3］，雖已廣泛用於腸道細菌的檢驗工作，但均不含尿素成份。如果檢驗尿素酶陽性的細菌須另做單獨的尿素管，改進後的培養基就可以減少繁瑣的單管試驗方法。該培養基的配製方法簡便易行、省時省力，不需要任何高端技術和儀器，適用於各類實驗室，尤其適用於基層腹瀉病門診實驗室工作。

    我們推薦使用的該培養基經過同行多年的工作實踐總結，已在當地推薦並長期使用，效果很好。我們相信該培養基在傳統的微生物分離技術上會給同行帶來方便，我們願與同行共享。

【參考文獻】
  1 P. R愛德華，W．H． 愛文. 腸杆菌科的鑒定.衛生部藥品生物製品檢定所.江西省衛生防疫站，第3版，1997：92.

2 陳夫元，劉捷.細菌培養基. 北京：中國科學技術出版社， 1992,149-156.

3 扳琦利一．他． 新細菌培地講座（第二版）下1. 東京:近代出版社，1993,180.

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