培養基成分對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響

【摘要】  　　目的研究MS培養基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響，篩選有利於彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的培養基配方。方法采用正交和單因素實驗設計，以生長40 d的彭澤貝母愈傷組織的生長率和生物堿含量為指標，評價各因素對其影響的大小。結果各因素對彭澤貝母愈傷組織生長影響大小依次為P>Ca>K>N,對生物堿積累影響大小依次為K>N>Ca>P；培養基中NO3-N含量較高時，有利於生物堿的積累；微量元素缺乏時均有利於彭澤貝母愈傷組織的生長，缺Cu、缺I時不利於生物堿的積累。結論有利於彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的最佳組合分別為：N3P1K3Ca2、 N1P2K3Ca1；培養基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量存在一定影響。

【關鍵詞】  彭澤貝母 愈傷組織 生長量 生物堿

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of large elements, trace elements of MS culture medium on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus ,and to select the culture medium which is advantageous in its growth and alkaloid accumulation.MethodsWith the growth rate and alkaloid content of the 40 days' callus as indexes, single-factor and orthogonal experimental design  was conducted to evaluate the impact of various factors.ResultsThe effect of various factors on the growth of the callus is P>Ca>K>N ,and on the alkaloids was K>N>Ca>P; the alkaloid content was higher when the proportion of NO3-N was higher than NH+4-N；Lacing trace elements were all advantageous in growth of the callus，but lacing I and Cu were not helpful to the accumulation of alkaloids. ConclusionThe best combination of the various factors for the growth and the accumulation of alkaloids of the callus respectively is: N3P1K3Ca2、 N1 P2 K3Ca1； large elements, trace elements of MS culture medium have effects on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus.

　　Key words：Fritillaria monantha Migo;   Callus;   Alkaloids ;   Growth
   
　　江西彭澤貝母Fritillaria monantha Migo主產於江西北部的彭澤、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等縣，已被確定為國產貝母屬植物在江西的新分布,彭澤貝母作川貝母使用已有多年的曆史，現代藥理學研究表明，彭澤貝母的藥理、藥效接近甚至優於幾種常用貝母。近年來，其需求量增大，人們過度采挖，導致其野生蘊藏量銳減，加上人工栽培條件嚴格，有性繁殖年限長，無性繁殖係數低，病蟲害防治難等，不能滿足人們長期用藥的需求。隨著近年來對植物生物化學研究的深入，利用植物細胞、組織或器官培養獲得並優化藥用植物次生代謝產物，以及最終利用遺傳工程製取次生代謝產物以滿足人類對藥用植物的巨大需求，已成為當前藥用植物生物技術領域的研究熱點。大規模藥用植物組織培養技術的成功，使藥用植物組織細胞培養技術在中藥領域得到了更深的研究和應用。本課題組研究了不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導的影響，並對其高產細胞做了篩選［1，2］。本文在此基礎上研究了MS培養基中無機成分對其生長及生物堿含量的影響，為進一步工業化生產奠定基礎。

　　1  材料與儀器

　　1.1  材料為本實驗室繼代培養的疏鬆的彭澤貝母愈傷組織。

　　1.2  藥品貝母素甲購自中國藥品生物製品檢定所，批號：110750-200607；氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純。

　　1.3  儀器UV7501紫外/可見分光光度計（無錫科達儀器廠）；SW-CJ-2F醫用淨化工作台（上betway必威西汉姆联訊）；PB303-N電子天平（瑞士梅特勒）；全自動高壓蒸氣滅菌鍋（上betway必威西汉姆联訊）等。

　　2  方法

　　2.1  培養條件以MS為基本培養基，NAA 2.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+KT 0.5mg/L為激素組合置於溫度（20±1）℃，光照強度為1 000-1 500lx，濕度為100%光照培養箱內培養。

　　2.2  生長量測定接種和取材前後均稱量培養基的重量,計算接種量、收獲量和增長率（每個處理3瓶）：接種量=接種後瓶重(g)-接種前瓶重(g)，收獲量=收獲前瓶重(g)-收獲後瓶重(g)，生長率（%）=收獲量(g)×100／接種量(g)。

　　2.3  對其生長及生物堿含量的影響以N，P，K，Ca為4個因素，MS培養基中原濃度、1/2濃度、1/4濃度3個水平，采用正交設計L9(34)進行實驗（見表1），培養40 d後取出材料，測定生長率和生物堿含量。表1  N，P，K，Ca含量正交設計因素水平表（略）

　　2.4  NH4+-N與NO3-N對愈傷組織生長及生物堿含量的影響培養基中的氮源改用KNO3和NH4Cl，總N濃度不變，研究其不同比例對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響，處理見表2。表2  銨態N與硝態N對其生長及生物堿含量的影響（略）

　　2.5  微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響以MS培養基為對照，把彭澤貝母愈傷組織接種到分別不加Fe，Mn，B，Mo，Zn，I，Co，Cu的培養基上，培養40 d後，取出材料測定生長率和生物堿含量。

　　2.6  生物堿的提取與含量測定生物堿的提取與含量測定參考劉紅寧［3］、上官一平［4］等的方法，並在此基礎上做了改進。

　　2.6.1  試劑的配製pH 5.0鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液：稱取4 g鄰苯二甲酸氫鉀，加熱溶解並定容至100 ml，用0.2 mol/L NaOH溶液調至pH 5.0。

    0.04%溴甲酚綠溶液配製：精密稱取溴甲酚綠80 mg，加入少量1 mol/L NaOH溶液溶解，定容至200 ml,置陰暗處備用。

　　2.6.2  標準溶液的配製精密稱取浙貝甲素0.006 3 g置於25 ml容量瓶中，加氯仿溶解，定容，得浙貝甲素標準溶液。

　2.6.3  標準曲線的製備精密吸取浙貝甲素標準液1，3，5，7，9 ml，用氯仿定容至10 ml,分別置分液漏鬥中，加水10 ml，溴甲酚綠溶液2 ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液2 ml，再精密加入三氯甲烷20 ml，密塞，搖勻，靜置30 min，分取氯仿層。另取氯仿10 ml，同法操作，所得氯仿層為空白，在411 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線，得回歸方程Y=12.071X+0.100 5,R2=0.998 8。見圖1。

　　2.6.4  最大吸收波長選擇取1 ml標準溶液萃取的氯仿層，照紫外-可見分光光度法在200～800 nm波長範圍內進行掃描，此對照品在411 nm波長處有最大吸收峰，故選擇411 nm為測定波長。
　　
　　2.6.5  樣品處理取彭澤貝母愈傷組織於60℃幹燥至恒重，粉碎，過4號篩，精密稱取貝母粉末0.5 g，用10%氨水2 ml濕潤30 min，加混合溶劑（氯仿∶甲醇=4∶1）20 ml超聲提取40 min，過濾，濾液於60°C水浴蒸幹，再用氯仿溶解，置分液漏鬥中，加水10 ml，溴甲酚綠溶液2 ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩衝液2 ml，再精密加入三氯甲烷（總30 ml），密塞，搖勻，靜置30 min，分取氯仿層，並定容至50 ml,另取氯仿30 ml，同法操作，所得氯仿層為對照。

　　3  結果

　　3.1　培養基中N、P、K、Ca含量對愈傷組織生長及生物堿含量的影響見表3。從表3可以看出，處理7愈傷組織增長率最大, 為108.42%,處理3最小,僅為38.11%；而生物堿含量最高的為處理3,含量為0.163%,最小的為處理4，僅為0.04%。通過直觀極差比較可知，RP>RCa>RK>RN，RK′>RN′>RCa′>RP′，表明各因素中對彭澤貝母愈傷組織生長的影響大小依次為P>Ca>K>N，而對生物堿積累影響大小則為K>N>Ca>P，有利於彭澤貝母愈傷組織生長的最佳組合為：N3P1K3Ca2，有利於彭澤貝母愈傷組織生物堿積累的最佳組合為：N1 P2 K3Ca1。表3  N、P、K、Ca含量對其生長及生物堿含量的影響（略）

　　3.2  銨態N與硝態N對愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見表4。從表4可以看出,處理5彭澤貝母愈傷組織的平均增長率最高為88.92%,即 NH4+/N03-為1/2時，其次為處理3為83.08%,即 NH4+/N03-為2/1時，當培養基中僅為NH4+-N時，增長率隻有8.68%，增長率最小的為空白對照，僅為4.67%；當NH4+/N03-為1/2時生物堿含量最高，達到0.164%，培養基中NH4+/N03-為1/2、1/4、僅N0-3-N時，生物堿含量均高於其他處理，在空白對照中生物堿含量最低。由此表明Ｎ源對彭澤貝母愈傷組織的生長分化及生物堿的積累是有一定影響的，隻有當不同形態的Ｎ源比例適宜時，才有利於愈傷組織的增殖和生物堿的積累。表4  銨態N與硝態N對其生長及生物堿含量的影響（略）

　　3.3  微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見圖2～3。從圖中可以看出，缺乏微量元素均有利於彭澤貝母愈傷組織的增殖，其中缺Co時增長率達到128.19%，生物堿含量遠遠高於對照；缺Zn、缺Fe時生物堿含量最高，達到了0.234%，缺I、缺Cu不利於生物堿的積累。

　　4  討論
   
　　培養基的組成是植物生長的一個決定因素，不同植物對培養基有不同的要求，並對培養基中的不同成分有不同的敏感性。本試驗發現，當MS培養基中NO-3-N的比例增高時有利於彭澤貝母愈傷組織中生物堿的積累。
   
　　微量元素在植物細胞生長中起著不可替代的作用，它們大多是酶的組成成分或活化劑，缺少其中一種就會代謝受阻，但是植物對其的需要量甚微，稍多就發生毒害。本文研究發現當培養基中缺B、缺Zn、缺Cu、缺Mo、缺Co、缺Mn、缺Fe、缺I時均有利於彭澤貝母愈傷組織的生長，但是缺Cu、缺I時不利於生物堿的積累，與近幾年研究的植物逆境有利於中藥有效成分的積累相一致［5］。

【參考文獻】
  　　［1］張壽文,劉賢旺, 黃慧蓮，等.不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導效應的研究［J］.江西中醫學院學報,2004, 16(4):52.

　　［2］張壽文,雷誌強,劉華，等.彭澤貝母組織培養和高產細胞係篩選研究［J］.江西農業大學學報,2007,29(1):152.

　　［3］劉紅寧, 顏冬梅,朱衛豐，等.HPLC-ELSD測定彭澤貝母中浙貝甲素和浙貝乙素［J］.中草藥，2006,37(4):600.

　　［4］上官一平,傅靜芝.酸性染料比色法測定川貝母中貝母素甲含量［J］.中南藥學,2006，4(2):130.

　　［5］黃璐琦,郭蘭萍.環境脅迫下次生代謝產物的積累及道地藥材的形成［J］.中國中藥雜誌,2007,32(4):277

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