作者熊禮寬 楊應周 莊玉輝
近年來，醫源性速生長分枝杆菌(Rapidly growing mycobacteria,RGM)感染暴發流行的報道日益增多，如手術傷口、器官移植、透析和注射後皮下感染等［1-4］。特別是龜分枝杆菌、偶發分枝杆菌等感染。龜分枝杆菌最初由Friedman於1903年從柏林動物園中的龜甲中分離出來，由於其生長速度快，故屬於RGM中的一種。龜分枝杆菌最初定名為偶發—龜型複合物，直到1955年Gordon等對其詳細描述後，才將龜分枝杆菌單獨定為一個種，1972年將其分為3個亞種：龜分枝杆菌龜亞種（M. chelonae subs.chelonae,以前又稱M.borstelense）、龜分枝杆菌膿腫亞種（M. chelonae subs.abscessus,以前又稱M.abscessus,M.runyonii,M.piscium和M.fridmanii）和類龜分枝杆菌（M.chelinae-like organisms,又稱M.Mucogenicum）［1］。
龜分枝杆菌是一種常見的環境腐物寄生菌，廣泛分布於水和醫院的灰塵中，故它是分枝杆菌醫源性感染最常見的菌種之一。盡管文獻報道有些龜分枝杆菌菌株對磺胺、紅黴素等敏感［4］，但多數菌株對常見抗結核藥物耐藥。一旦感染，其臨床上治療比較困難，故應盡早明確診斷，控製醫源性暴發流行。
一、塗片染色檢查
自從1882年Koch發現結核分枝杆菌以來，塗片抗酸染色一直是臨床上檢查抗酸杆菌的首選方法，它包括直接塗片染色和濃縮集菌後塗片染色兩種方法，染色方法以萋納抗酸染色法為主［3］。尚有熒光染色法：金胺O染色法和吖啶橙染色法，由於熒光染色法采用高倍顯微鏡檢查，陽性率高於抗酸染色，已被越來越多的實驗室所接受［5］。當疑為分枝杆菌感染時（如久治難愈的傷口等），取傷口分泌物或痰液，首先應塗片染色檢查分枝杆菌，同時進行分枝杆菌培養。
二、培養
盡管分枝杆菌培養基種類很多，但初代培養首選培養基為改良羅-瓊(Lowenstein-Jensen)培養基，有條件的實驗室可選用7H12B培養基(Becton dickinson公司)或變色液體培養基 (深圳市怡百世生物技術有限公司、MB-Redox biotest公司)，它們適用於臨床上各種標本分離培養分枝杆菌，如痰、膿液、分泌物等。當傷口分泌物疑為RGM感染所致，綜合性醫院實驗室可采用血液瓊脂平板培養基或麥康凱(MacConkey)瓊脂平板培養基(無氯化鈉)分離培養［1，5，6］，尤其適用於除痰以外的其他標本。由於龜分枝杆菌廣泛存在於環境中，常表現為一過性，從痰中較易分離出來，但並不表示龜分枝杆菌所致呼吸道感染，必須連續3次分離出同1菌株，依據非結核分枝杆菌病診斷標準，方可診斷為龜分枝杆菌感染。
三、生物學鑒定
1.龜分枝杆菌
2.當確定為RGM後，應進行芳香硫酸酯酶（3 d、14 d）試驗、硝酸鹽還原試驗、鐵吸收試驗、麥康凱瓊脂生長試驗和
3.待鑒定為龜分枝杆菌後，進行5%氯化鈉耐受試驗、2%苦味酸耐受試驗、碳源（枸櫞酸鹽、甘露醇和肌醇等）底物利用試驗，以鑒別龜分枝杆菌龜亞種、龜分枝杆菌膿腫亞種和類龜分枝杆菌［7］。在進行生物學鑒定時，對於菌齡、菌量、溫度、氣體等都應標準化。如龜分枝杆菌進行5%氯化鈉耐受試驗時，菌齡為對數生長期，菌量為1McFarland單位，溫度為
此外，高壓液相色譜分析分枝菌酸也可用作龜分枝杆菌鑒定的輔助指標［8］。
四、分子生物學鑒定
1.隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)：RAPD又稱任意引物PCR。Williams最先使用的引物為9～10個bp，但RAPD技術現在采用的引物多為1條10～25個bp寡核苷酸序列，能在基因組DNA的長鏈中多處特異性的結合，因而產生相應數量的擴增片段。由於DNA序列上個別堿基的不同，如果發生在隨機引物結合部位則改變擴增片段的數量，如果發生在引物結合部位之間，則改變某些擴增片段的長度，產生不同的DNA圖譜。Linton等［9］在進行結核分枝杆菌DNA多態性分析時發現，引物長度為20個堿基最佳，他們同時篩選了40條引物，結果發現MTBC-RF、INS-2和IS986-FP引物能較好的用於結核分枝杆菌分型。Zhang等［10］篩選了10條引物用於龜分枝杆菌龜亞種、龜分枝杆菌膿腫亞種分型，結果表明OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物較好。Lai等［11］同樣采用OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物鑒定龜分枝杆菌膿腫亞種所致的醫源性感染也取得了滿意的結果。我們的研究結果與此一致［12］，但是，為了獲得較好的重複性，模板最好采用標準酚-氯仿抽提法或DNA提取試劑盒，模板存放時間不要太長，模板DNA濃度在0.3～1.0μg時，相應的引物濃度為1.6～6.4 μmol/L，鎂離子濃度為2～2.5 mmol/L。
2.脈衝瓊脂電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE):盡管PFGE已經代替質粒圖譜（技術複雜）作為RGM DNA指印的主要方法，但約有50%的龜分枝杆菌膿腫亞種通過此法不能得到正確的結果［2，13］。Lai等［11］采用DraⅠ、XbaⅠ、AseⅠ和SpeⅠ消化龜分枝杆菌膿腫亞種染色體總DNA，進行PFGE，其結果不令人滿意。Zhang等［10］采用DraⅠ、XbaⅠ或AsnⅠ消化龜分枝杆菌染色體總DNA，進行PFGE，結果9株龜分枝杆菌龜亞種PFGE圖譜尚可，但118株龜分枝杆菌膿腫亞種隻有46株結果令人滿意。
3.PCR-限製性酶切圖譜分析（PCR-restriction enzyme pattern analysis,PRA）：PRA是根據PCR擴增分枝杆菌屬共有的分子量65 000熱休克蛋白（heat shock protein,hsp-65）基因，產物經限製性內切酶消化，電泳後而形成的圖譜分析，檢測和鑒定分枝杆菌，用於診斷結核分枝杆菌和非結核分枝杆菌感染。Wilson等［14］擴增hsp-65基因中439 bp片段，擴增片段經限製性內切酶BstEⅡ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ、BsaHⅠ（必要時使用AciⅠ、HhaⅠ、NarⅠ）消化，293株需氧放線菌（其中170株分枝杆菌）中274株得到了正確鑒定。Steingrube等［15］擴增hsp-65基因中439 bp片段，擴增片段經限製性內切酶HaeⅢ和/或BstEⅡ消化，24株龜分枝杆菌膿腫亞種、16株龜分枝杆菌龜亞種和20株類龜分枝杆菌，正確鑒定率分別為96、94和100%。我們按照Steingrube等［15］報道的方法對7株導致醫源性感染的龜分枝杆菌膿腫亞種進行鑒定，證實可能為同一菌株所致的醫源性感染。此外，還有應用其它的靶基因序列進行PRA分析，如IS6110、16SrRNA、23 srRNA或16S-23SrRNA間隔序列。
五、藥物敏感試驗
龜分枝杆菌藥物敏感試驗方法有瓊脂擴散法、絕對濃度法和Mueller-Hinton肉湯稀釋法等［16-20］。治療龜分枝杆菌感染主要依靠藥敏試驗選擇藥物及手術清創。龜分枝杆菌多對常見的抗結核藥物耐藥，一旦確定為龜分枝杆菌，則不必再做常規抗結核藥物敏感試驗［1］。Wallace等［16］研究表明：龜分枝杆菌龜亞種（59株）均對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁和頭孢美唑耐藥，61%的菌株對亞胺培南耐藥；龜分支杆菌膿腫亞種（141株）對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁和頭孢美唑耐藥率分別為67%、13%和24%，亞胺培南耐藥率為43%。克拉黴素是一種類似與阿齊黴素的大環內酯抗生素，已廣泛用於治療RGM感染。Villanueva等［2］單用克拉黴素治療35例龜分枝杆菌膿腫亞種感染者，治愈率為23%；手術聯合克拉黴素治療148例龜分枝杆菌膿腫亞種感染者，治愈率達95%。盡管如此，在美國1990～1995年期間800例龜分枝杆菌感染者中，已有12例龜分枝杆菌膿腫亞種和6例龜分枝杆菌龜亞種感染複發者，克拉黴素MIC≥16μg/ml，其中已證實13例為23sRNA peptidyltransferase 點突變，即2058（38%）或2059（62%）位A變成了G或C［16］。關於克拉黴素、亞胺培南、環丙沙星、氧氟沙星、頭孢西丁、妥布黴素和阿米卡星的MIC，不同的菌株差異較大［19，20］。
作者單位：熊禮寬(518020深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所檢驗科)
楊應周(518020 深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所檢驗科)
莊玉輝(解放軍第三○九醫院全軍結核病研究中心)
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