椰毒假單胞菌酵米麵亞種鳥嘌呤和胞嘧啶含量的測定及2種測定方法的比較

　摘要：利用複性速率法(Tm值法)和高效液相色譜法(HPLC法)對生化性狀比較相近的椰毒假單胞菌酵米麵亞種、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌和椰毒伯克霍爾德氏菌共7個菌株的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)摩爾百分含量(G+C)%進行了測定，並對這2種方法做了對比研究。結果發現，3個種的7個菌株的(G+C)%比較接近，不能否定這3個種的細菌屬於同一個種。另外，HPLC法比Tm值法的準確性好，但重複性不如後者。
　　中圖分類號：R155.31　TS207.4　　　　　文獻標識碼：B
　　文章編號：1000-8020(2000)04-0243-03
Determination of guanine plus cytosine content of Pseudomonas cocovenenans
　　subsp farinofermantans with two methods and the comparative study
　　Jiao Zhenquan, Liu Xiumei, Yang Ruifu, Guo Zhaobiao, et al.
　　(Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050, China)
　　Abstract：The guanine plus cytosine content(G+C) mol% of Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans, Burkholderia gladioli and Burkholderia cocovenenans, which were similar in biochemical characteristics, were determined with Tm values method and HPLC method, and the comparative study of these two methods was discussed. A negative conclusion could not be made from the results. The three bacteria were the same species. The HPLC method was more accurate than the Tm values method, but the repeatability of the latter was better.
　　Key words:Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans, guanine plus cytosine content
　　近10多年來，細菌分類學發展迅速，已從傳統的表型分類發展為現在的係統分類和多相分類。特別是隨著分子生物學理論和技術的不斷完善，產生了各種遺傳型分類方法，如鳥嘌呤和胞嘧啶摩爾百分含量(G+C)%、DNA-DNA雜交、質粒圖譜、限製性片段長度多態性分析和16S rRNA基因序列分析等。它們主要是對細菌染色體進行直接的DNA分析或對染色體外的DNA片段進行分析，從遺傳進化的角度去認識細菌，從分子水平進行分類與鑒定。
　　生物遺傳的物質基礎是核酸，嚴格地說是DNA。細菌DNA由4個堿基組成，分別是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA堿基組成的不同即可反映細菌之間的親緣關係，親緣關係疏遠的細菌，它們的(G+C) %大小不同，而親緣關係近的細菌，它們的(G+C) % 就相同或相近。測定細菌(G+C) %的方法很多，有複性速率法(Tm值法)、氯化銫密度梯度離心法、氣-液相色譜法、天然DNA光譜分析法、變性DNA光譜分析法、溴化反應、酸變性和光譜分析法、雙頻率分析法和高效液相色譜法(HPLC法)，其中比較常用的有Tm值法和HPLC法。Tm值法是根據DNA的增色性質，測定溶解溫度(Tm)即增色效應一半時的溫度而獲得的^［1］；HPLC法是根據細菌染色體DNA核苷酸的4種堿基在高效液相色譜圖上會出現4個不同的峰，以標準的核苷酸堿基或標準菌株作為參照，根據不同的峰高和峰麵積計算樣品的4個堿基的含量，進而計算出細菌DNA的(G+C) %^［2］。
　　本文以生化性狀比較相近的椰毒假單胞菌酵米麵亞種(簡稱椰酵假單胞菌，Pseudomonas cocovenenans subsp farinofermantans)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)和椰毒伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cocovenenans)為例，通過Tm值法和HPLC法測定它們的(G+C) %，進而對這2種方法進行比較。
　　1　材料和方法
　　1.1　菌株
　　選用不同食物來源和不同血清型的椰酵假單胞菌5株與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌模式株及椰毒伯克霍爾菌模式株進行測定。菌株詳細情況見表1。
　　1.2　染色體DNA的提取
　　將實驗菌株接種於PDA固體培養基37℃培養過夜；挑取單個菌落接種於150ml液體LB培養基中，於37℃、120r/min振蕩培養過夜；培養液在8 000r/min離心5min，棄去上清，稍幹燥，將菌體重懸於5ml的SE緩衝液中(輕微操作)，加入10%SDS溶液1ml,於65℃水浴10min，可見菌體澄清透明；向菌懸液中加入等體積的飽和酚和二分之一體積的氯仿-異戊醇(24∶1)充分振搖，脫蛋白5min，9000r/min 4℃離心10min使溶液分層；吸取上層水相，並在水相中加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)重複脫蛋白2次，使中間無蛋白層；吸取上層水相，並在水相中加入10mg/ml的RNase 30μl，使其終濃度為100μg/ml，於37℃溫箱中作用1h；加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，充分振搖，9000r/min離心10min，重複脫蛋白至中間無蛋白層；吸取上層水相，加入2倍體積的95%乙醇，用玻璃棒將絲狀染色體DNA纏在玻璃棒上，幹燥；將DNA溶於2ml的蒸餾水中，置於-20℃保存。
表1　實驗菌株⁽¹⁾

　　注：(1) T：Type strain.模式株；ATCC：American Type Culture Collection, Rockville, MD,USA;NCIB:National Collection of Industrial Bacterial, UK.
　　1.3　利用核酸和蛋白質分析儀(Beckman公司)進行測定
　　選取大腸杆菌K₁₂作為參考菌株，0.1×SSC溶液作為空白對照；測定所提取DNA的濃度和純度，稀釋使其濃度為50～75μg/ml,A₂₆₀/A₂₈₀＞1.8；在比色杯中加入360μl的待測樣品，用熱隔離蓋子蓋牢；根據估計的Tm值，選用65℃作為起始測定溫度，95℃作為終止溫度，溫度的上升速率為1℃/min，A₂₆₀讀取速率為1次/℃；每個樣品重複測定3次，取相近2次的平均值作為最終結果。(G+C)的計算公式如下：(G+C) %=(Tm_測定-Tm_K12)×2.08+51.2
　　式中Tm：儀器給出的Tm值；Tm_K12：大腸杆菌K₁₂的Tm值。
　　1.4　利用高效液相色譜法(HPLC)進行測定
　　在上麵提取的DNA中加入RNaseT1(終濃度為100U/ml)，37℃作用30min；用酚-氯仿混合物進行抽提，用乙醇進行沉澱；將沉澱溶於滅菌水中，調整其濃度為1mg/ml；100℃熱變性5min，立即置於冰上冷卻；加入2U/ml的核酸酶P1溶液10μl，於50℃作用1 h；加入2.4U/ml的堿性磷酸酶溶液10μl於37℃作用30min；取10μl樣品在高效液相色譜儀上進樣；選取大腸杆菌K₁₂作為參考菌株；每個樣品測定2次，如相近，則取平均值，反之，再測定1次，取相近2個值的平均值作為最終結果。
　　高效液相色譜測定條件是選用C18 RA-DIAL-PAK色譜柱，填充料為Z-MOD-ULE，流動相是0.2mol/L的磷酸二氫胺(pH4.0)與乙腈的混合液，流速為1ml/min，檢測器為UV270nm的Lambda-Max Model 481 LC熒光檢測器，記錄儀為Shimadzu Chromatopac C-R2AX。2　結果
　　根據Tm值法和HPLC法對椰酵假單胞菌、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌和椰毒伯克霍爾德氏菌進行(G+C) %的測定，相應的結果如圖1和圖2所示。圖1中的5條曲線從上向下分別為HN2y、大腸杆菌、大腸杆菌、Co14和Sx8801，其中大腸杆菌為重複測定，從圖中可以看出：實驗結果比較穩定，大腸杆菌相同樣品的測定結果完全一致，待測菌株比大腸杆菌的Tm值高。根據儀器給出的Tm值，利用公式得到了各個待測菌株的(G+C) %，如表2所示。圖2中的4個高峰分別為dC、dG、dT和dA，儀器根據峰高和峰麵積給出了待測菌株的(G+C)%，結果見表2。
圖1　Tm值法測定待測菌株(G+C) %的熱變性曲線
圖2　HPLC法測定待測菌株(G+C) %的色譜圖及保留時間
表2　待測菌株的(G+C) %

3　討論
　　本世紀50年代末，科學工作者們就已經根據細菌染色體的A、T、G、C組成而開始測定(G+C)%作為細菌分類和鑒定的一種手段。隨著研究的深入，人們發現每個生物物種都有特定的(G+C)%，如：動植物DNA中的(G+C)%的範圍較窄和相似，主要集中在35%～40%，而細菌DNA的(G+C)%變動幅度很寬，可達24%～76%，但每一種細菌的變化範圍較小，並且G+C含量較為穩定，不受菌齡的影響，同時也不受除去突變因素之外的生長條件等各種外界因素的影響，因而該指標被認為是細菌分類鑒定中一項很有意義的鑒別特征。目前細菌分類也已將DNA中的(G+C)%作為常規的鑒定指標之一。
　　對於利用細菌DNA的(G+C)%對其進行分類目前還沒有一個大家公認的統一準則，一般可以遵循下述原則^［3］：一個種的(G+C)%的差異不大於3%～4%；一個屬內的差異通常在10%～15%；若差別在20%～30%，則可以認為是不同屬，甚至不同科內的細菌；如果2個菌株的(G+C)%差異大於4%，就可判定這2株菌不屬於同一個種；如果2個菌株的(G+C)%差異在4%以內，則不能判定兩者是否屬於同一個種，因為關係相近的細菌，其(G+C)%必定相近，但關係遠的細菌其(G+C)%也可能相近(G+C含量相同，它們的堿基排列順序則不一定相同)。所以說(G+C)%在細菌分類學上的作用主要是否定。
　　本文中Tm值法的各個菌株3次測定的結果相差有大有小，大腸杆菌K₁₂作為參照菌株，3次的Tm值測定結果比較一致，為了保證測定結果的一致性，均選用測定結果相對一致的2次測定值的平均值作為最終測定結果。這7株細菌的(G+C)%範圍是65.7～67.9，與伯克霍爾德氏菌屬的(G+C)%範圍基本一致^［4］。其中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌與椰毒伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值分別為67.3和67.7，二者相差0.4(0.6%)，其中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值(67.3)測定值與Bergey's手冊上(G+C)%值(68.5)有一定的差別。椰酵假單胞菌的5個菌株的(G+C)%值為65.7～67.9，與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌和椰毒伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值非常接近，與它們相差的範圍分別是0.6～1.6(0.89%～2.38%)和0.2～2.0(0.30%～2.95%)。
　　各個實驗菌株的HPLC法2次的測定結果非常相近，K₁₂作為參照菌株的測定值基本一致，分別是50.9和51.1，平均值是51.0，與文獻報道的比較權威的數據51.2基本一致。待測菌株中，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值為68.3，椰毒伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值為68.8，它們的(G+C)%值相差0.5～1.3(0.73%～1.89%)，其中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的(G+C)%測定值(68.3)與Bergey's手冊上的(G+C)%值(68.5)基本一致；椰酵假單胞菌的5個菌株的(G+C)%值分別為68.5、67.8、69.1、69.8和65.8，與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌和椰毒伯克霍爾德氏菌的值也相差不大，差值範圍分別是1.5～2.5(2.20%～3.66%)和1.3～2.7(1.89%～3.92%)，隻有Co18的(G+C)%值相對較低，結果導致差值範圍較大。2種測定方法的Co18的(G+C)%的值均較小。
　　本文測定的各個實驗菌株的(G+C)%的差值範圍均在4%之內，根據它們的生化性狀比較相近和(G+C)%的原則要求，我們可以得出一個結論：即不能否定這3個種可能屬於同一個種。
　　另外，就這2種測定方法而言，Tm值法是物理學方法，根據的是樣品的溶解溫度，是一種非直接方法；而HPLC法是化學方法，根據的是裂解後的寡核苷酸堿基色譜峰的不同，是一種直接方法。Tm值法結果的可信性不如HPLC法，由於物理過程和參考菌株數值的不確定而導致產生實驗誤差。HPLC法的準確度很高，但重複性不如Tm值法。2種方法測得的(G+C)%有一定的差別，總的趨勢是HPLC法比Tm值法的測定值要高一些，相差0.1～2.1(Co18相差0.1，Co14相差2.1)。Tm值法與HPLC法對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌與椰毒伯克霍爾德氏菌的(G+C)mol%測定結果分別是67.3、67.7和68.3、68.8。Urakami通過HPLC法測定的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的(G+C)%是67.9^［5］，Bergey's手冊上的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的(G+C)%值是68.5，Zhao通過Tm值法測定在椰毒伯克霍爾德氏菌的(G+C)%是68.5^［6］。本研究的HPLC法測定結果與他們的結果比較相近。
　　Tm值法與HPLC法均具有一定的優點和缺點，(G+C)%作為細菌係統分類的一個重要的分類特征，當務之急是要對其測定方法進行標準化，采用一種分類學家都能接受的方法。但無論采用哪一種方法，比較關鍵的是要保證提取的DNA純度，特別是HPLC法一定要盡量減少RNA的汙染。為了做到這一點，最好是對細菌進行大量培養，采用提取大量DNA的方法。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.39570619)
　　

作者：焦振泉  劉秀梅  楊瑞馥  郭兆彪  河村好章

作者單位：中國預防醫學科學院營養與食品衛生研究所 北京100050 中國預防醫學科學院營養與食品衛生研究所!北京100050 中國軍事醫學科學院微生物與流行病研究所 中國軍事醫學科學院微生物與流行病研究所 日本岐阜大學醫學部微生物教室

　　參考文獻
　　1，Grimont PAD, Popoff MY, Grimont F, et al. Use of DNA reassociation in bacterial classification. Can J Microbiol, 1998,34:541-546
　　2，Kaneko T, Katoh K. Determination of the nucleotide composition of a deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography of its enzymatic hydrolysate: a review. J Microbiol Methods, 1986,4:229-240
　　3，林萬明.細菌分子遺傳學分類鑒定法.上海：上海科學技術出版社.1990
　　4，Yabuuchi E, Kosako Y, Oyaizu H, et al. Proposal of Burkholderia gen.nov.and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group Ⅱ to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia(Palleroni and Holms,1981) comb.nov.Microbiol Immunol, 1992,36(12):1251-1275
　　5，Urakami T, Yoshida CI, Araki H, et al. Transfer of Pseudomonas plantarii and Pseudomonas glumae to Burkholderia as Burkholderia spp. and description of Burkholderia vandii sp.nov.Int J Syst Bacteriol, 1994,44(2):235-245
　　6，Zhao NX, Wang ET, Cheng WX, et al. Comparative description of Pseudomonas cocovenenans (van Damme, Johannes, Cox, and Berends 1960) NCIB9450^T and Strains isolated from cases of food poisoning caused by consumption of fermented corn flour in China. Int J Syst Bacteriol, 1990,40(4):452-455

上一篇：大腸埃希菌耐環丙沙星gyrA基因突變的研究

下一篇：椰毒假單胞菌酵米麵亞種食物中毒診斷標準及處理原則