摘 要 為得到益生芽抱杆菌Bacillus subtilis MA139產芽抱的最佳的培養基，以搖瓶發酵的方法，用P1ackett-Burman設計從l1種原料中篩選出4種對芽抱產量有顯著影響的因素，即玉米粉、大豆粉、蛋白腖和MnSO4·H2O，然後針對這4個主要因素，用最陡爬坡試驗及中心組合設計優化產芽抱的最佳培養基。結果證明，當培養基的配方為：玉米粉
關鍵詞:枯草芽孢杆菌；發酵；培養基優化；試驗設計
抗生素添加劑在動物日糧中廣泛使用，但其弊端和危害日益體現出來[1]，而抗生素替代品的微生態製劑在畜牧業已得到應用[2]。微生態製劑常用的細菌是乳酸菌，而芽孢杆菌作為動物腸道的外源菌群，也有廣泛應用，它能夠改善動物胃腸道的微生態平衡，促進動物生長，提高飼料利用率[3-6]。優良的微生態製劑必須有足夠的活菌數量[7]。因此，為了盡量提高產品芽孢的數量，需要對其產芽孢的培養基進行係統優化，以降低生產成本，提高芽孢得率[8]。
芽孢杆菌液體深層發酵培養基的優化一般采用單因子試驗以及結合均勻設計和正交設計的方法[9-10]。目前趨向采用統計軟件構建高效試驗設計來進行微生物培養基的優化，通過對試驗結果進行數學模擬和優化，可以簡化試驗步驟，提高準確性[11-14]。本試驗旨在以本試驗室分離篩選得到的一株枯草芽孢杆菌MA139為出發菌株，優化產芽孢的最適培養基。
1、材料與方法
1.1、菌株
枯草芽孢杆菌MA139，本實驗室自行分離和保存。該菌株經中科院微生物所鑒定，其16S rRNA基因序列在GenBank的登錄號為DQ415893。該菌株具有飼用益生菌的應用潛力。
1.2、培養基
1)種子及斜麵保存培養基(SC培養基)
成分為葡萄糖
2)發酵培養基
分別按照Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗設計和中心組合設計的方法來配製。
1.3、試劑和原料
玉米、大豆為市售，粉碎後過2O目篩備用；試驗中其他試劑均為分析純。
1.4、培養條件
1)種子培養條件
250 mL三角瓶裝種子培養基5OmL，接斜麵活化後的種子一環，
2)發酵培養條件
250mL三角瓶裝發酵培養基5OmL，按照4％的接種量接種後在
1.5、細菌總數和芽孢總數的測定
平板稀釋法計數活菌數。芽孢計數則將稀釋液放入8O℃水浴中處理20min後培養計數。
1.6、培養基優化試驗設計
1)Plackett-Burman設計
在優化初期利用Plackett-Burman設計法[15]，以葡萄糖(X1)、可溶性澱粉(X2)、玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、(NH4)2SO4(X5)、尿素(X6)、蛋白腖(X7)、MgSO4·7H2O(X8)、KH2PO4(X9)、CaC12(X10)、MnSO4·H2O(X11)等為試驗因子，對這11種原料進行全麵考察，並將其編碼為-1和+1的高低二階層，其所代表的質量濃度值，見表1。
選用”n=12的Plackett-Burman設計，並加上3個中心點來篩選和探討11個試驗因子對細菌總數和芽孢總數的影響，每個試驗結果報告為2個重複試驗的平均值，見表2。
|
表1 Plackett-Burman試驗設計中各參數的編碼值及其質量濃度 g/L | ||
|
獨立變量 |
編碼水平 | |
|
-1 |
+1 | |
|
葡萄糖(X1) |
5 |
15 |
|
可溶性澱粉(X2) |
5 |
15 |
|
玉米粉(X3) |
5 |
15 |
|
大豆粉(X4) |
10 |
30 |
|
(NH4)2S04(X5) |
2 |
6 |
|
尿素(X6) |
3 |
9 |
|
蛋白腖(X7) |
5 |
15 |
|
MgS04·7H2O(X8) |
0.5 |
1.5 |
|
KH2P04(X9) |
1 |
3 |
|
CaCl2(X10) |
2 |
6 |
|
MnS04·H2O(X11) |
0.05 |
0.5 |
2)最陡爬坡試驗設計
響應麵擬合方程隻有在考察的緊接鄰域裏才充分近似真實結果，故隻有在最先逼近最大目標產物產量區域後才能建立有效的響應麵擬合方程[16]。以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，從而快速逼近產量最大值。根據Plackett-Burman設計的結果，來確定是否進行最陡爬坡試驗。
3)中心組合設計
根據Plackett-Burman設計篩選出的試驗因子和最陡爬坡試驗確定的逼近濃度，以JMP5.0軟件設計中的DOE程序進行中心組合試驗，擬合數據得到一個描述因變量(細菌總數)與自變量(培養基組分)關係的二階經驗模型[11-17]：y=bo+ΣbiXi +ΣbijXiXj+ΣbiiX2ii；式中：y為預測響應值，即細菌總數(
2、結果與討論
2.1、影響芽孢杆菌增殖的重要因素
按照Plackett-Burman試驗設計，在發酵36h時取樣測定發酵液當中的細菌總數(total number，Ntot)和芽孢總數(spore number，Ns)。Plackett-Burman試驗設計結果見表2並對其進行一階模式回歸分析(表3)。細菌總數和芽孢總數2種結果回歸分析的檢定係數分別為0.96和0.94，說明回歸分析能夠確切地描述試驗數據。根據分析結果，發現對B.subtilis MA139發酵起主要作用有4種原料，即玉米粉、大豆粉、蛋白腖和MnSO4·H2O，並對11種原料成分歸納調整，作為下一步試驗分析的依據。質量濃度調整說明見表4。
|
表2 Plackeet-Burman試驗設計結果(n=12) | |||||||||||||
|
編號 |
變量水平 |
響應值 | |||||||||||
|
X1 |
X2 |
X3 |
X4 |
X5 |
X6 |
X7 |
X8 |
X9 |
X10 |
X11 |
lg[Ntot/(cfu/ml)] |
lg[Ns/(cfu/ml)] | |
|
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
8.69 |
8.48 |
|
2 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.37 |
9.35 |
|
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.01 |
8.99 |
|
4 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
8.41 |
8.40 |
|
5 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.31 |
9.29 |
|
6 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
8.43 |
8.32 |
|
7 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
9.25 |
9.24 |
|
8 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.07 |
9.06 |
|
9 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
8.23 |
8.18 |
|
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.05 |
9.05 |
|
11 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
8.30 |
8.26 |
|
12 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
9.15 |
9.15 |
|
13 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
9.06 |
8.94 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.02 |
9.01 |
|
15 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
8.79 |
8.74 |
|
表3 Plackeet-Burman試驗設計回歸分析結果 cfu/L | ||||||
|
截距參數 |
細菌總數Ntot |
芽孢總數Ns | ||||
|
參數估計 |
t |
P |
參數估計 |
t |
P | |
|
intercept |
8.876 |
203.044 |
0.000 |
8.831 |
163.294 |
0.000 |
|
X1 |
-0.147 |
-3.001 |
0.058 |
-0.129 |
-2.136 |
0.122 |
|
X2 |
0.003 |
0.068 |
0.950 |
-0.009 |
-0.152 |
0.889 |
|
X3 |
-0.152 |
-3.103 |
0.053* |
-0.163 |
-2.688 |
0.075* |
|
X4 |
-0.190 |
-3.888 |
0.030** |
-0.221 |
-3.652 |
0.035** |
|
X5 |
-0.005 |
-0.102 |
0.925 |
-0.021 |
-0.345 |
0.753 |
|
X6 |
-0.082 |
-1.671 |
0.193 |
-0.099 |
-1.640 |
0.200 |
|
X7 |
-0.173 |
-3.547 |
0.038** |
-0.159 |
-2.633 |
0.078* |
|
X8 |
0.088 |
1.807 |
0.168 |
0.108 |
1.788 |
0.173 |
|
X9 |
0.097 |
1.978 |
0.142 |
0.106 |
1.750 |
0.178 |
|
X10 |
-0.005 |
-0.102 |
0.925 |
-0.034 |
-0.565 |
0.612 |
|
X11 |
0.157 |
3.205 |
0.049** |
0.158 |
2.605 |
0.080* |
|
P=0.082，RSq=0.96 P=0.125，RSq=0.94 | ||||||
注：*為P＜0.1，**＜0.05。
|
表4 Plackeet-Burman試驗設計各因子結果的質量濃度分析 | |||
|
試驗因子 |
質量濃度（g/L） |
說明 | |
|
調整前 |
調整後 | ||
|
葡萄糖(X1) |
5-15 |
5 |
對細菌總數和芽孢總數為負相關，對細菌總數影響達到顯著水平，而對芽孢總數的影響不顯著，為了減少試驗因子，維持在低水平 |
|
可溶性澱粉(X2) |
5-15 |
刪除 |
無顯著影響，可信度大於20%，刪除此因子 |
|
玉米粉(X3) |
5-15 |
1-5 |
負顯著，降低篩選濃度 |
|
大豆粉(X4) |
10-30 |
1-10 |
負極顯著，降低篩選濃度 |
|
(NH4)2S04(X5) |
2-6 |
刪除 |
無顯著影響，可信度大於20%，刪除此因子 |
|
尿素(X6) |
3-9 |
3 |
不顯著，負相關，可信度小於20%，為減少試驗因子，維持在低水平 |
|
蛋白腖(X7) |
5-15 |
1-5 |
負顯著，降低篩選濃度 |
|
MgS04·7H2O(X8) |
0.5-1.5 |
1.5 |
不顯著，可信度小於20%，為減少試驗因子，維持在高水平 |
|
KH2P04(X9) |
1-3 |
3 |
不顯著，正相關，P值相對較小，維持在高水平 |
|
CaCl2(X10) |
2-6 |
刪除 |
不顯著，可信度大於20%，刪除此因子 |
|
MnS04·H2O(X11) |
0.05-0.5 |
0.5-1.5 |
顯著，正相關，提高篩選濃度 |
2.2、最陡爬坡試驗
選取對 B.subtilis MA139發酵 4種主要原料。對Plackett-Burman試驗設計中得到的結果進行t檢驗，比較中心點水平的平均響應值與試驗點處的平均響應值間的差異顯著性。試驗結果顯示，中心點水平與試驗點間在a=0．05水平上不顯著(P值分別是0.460和0.388)，這就表明本試驗設計中選取的中心點水平還沒有接近最大的響應區域內，因此還必須進一步尋找中心點值，也就是最陡爬坡試驗。
以回歸係數最大的大豆粉(X4)為基準，以每次減少濃度1%為基本步長(△)。處理5中的細菌總數和芽孢總數達到了最高，這一結果表明，處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白腖(X7)、MnSO4·H20(X11)這4種物質濃度已在最優點附近，可以此濃度為中心點采用中心組合設計來對培養基作進一步的優化(表5)。而且在Plackett-Burman設計及最陡爬坡試驗中，細菌總數與芽孢總數的分析結果一致，故在以下的中心組合設計僅以發酵液的細菌總數作為考察目標。
|
表5 最陡爬坡試驗設計及其結果 | ||||||
|
處理序號 |
培養基成分/（g/L） |
結果 | ||||
|
玉米粉（X3） |
大豆粉（X4） |
蛋白腖（X7） |
MnSO4·H20（X11） |
lg[Ntot/(cfu/ml)] |
lg[Ns/(cfu/ml)] | |
|
1 |
5.00 |
10.00 |
5.00 |
0.50 |
9.33 |
9.28 |
|
2 |
4.52 |
9.00 |
4.52 |
0.61 |
9.37 |
9.30 |
|
3 |
4.08 |
8.00 |
4.08 |
0.72 |
9.13 |
9.12 |
|
4 |
3.64 |
7.00 |
3.64 |
0.83 |
9.34 |
9.29 |
|
5 |
3.20 |
6.00 |
3.20 |
0.94 |
9.43 |
9.40 |
|
6 |
2.76 |
5.00 |
2.76 |
1.05 |
9.39 |
9.34 |
|
7 |
2.32 |
4.00 |
2.32 |
1.16 |
9.10 |
9.01 |
|
8 |
1.88 |
3.00 |
1.88 |
1.27 |
9.17 |
9.15 |
|
9 |
1.44 |
2.00 |
1.44 |
1.38 |
9.06 |
8.95 |
|
10 |
1.00 |
1.00 |
1.00 |
1.50 |
8.91 |
8.84 |
2.3、中心組合設計
以最陡爬坡試驗中處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白腖(X7)、MnSO4·H2O(X11)的濃度為中心點進行優化，選擇中心試驗點為3，星號臂長γ=1.547。各自變量水平見表6，試驗設計及結果見表7。
分析結果表明(表8)，模型極顯著(P＜0.01)，並且有很好的確定係數，RSq=0.93。這表明B.subtilis MA139細菌總數93%的可靠性可由模型來預測。並可以通過回歸分析結果得出試驗模型：
y=9.434-0.003X3-0.025X4+0.028X7-0.013X11-0.006X3X4-0.02X3X7-0.009X4X7-0.012X3X11-0.026X4X11-0.03X7Xll-0.068X3X3-0.013X4X4-0.043X7X7-0.025X11X11
自變量前的數值為回歸模型對應項的 P值。
根據JMP模型的分析結果以及二次回歸方程可以得出，此模型具有最大響應值，極值分析結果見表9。根據結果換算成4個主因素的實際濃度值，即玉米粉
為了檢驗模型預測的準確性，采用優化的培養基重複試驗3次，發酵液當中平均細菌數為 2.91×l09cfu/mL，這表明實驗值和實際值之間具有良好的擬合性，優化模型可靠。
|
表6 中心組合設計各因子及其編碼值 g/L | |||||
|
獨立變量 |
編碼水平 | ||||
|
-1.547 |
-1 |
0 |
1 |
1.547 | |
|
玉米粉（X3） |
1.65 |
2.20 |
3.20 |
4.20 |
4.75 |
|
大豆粉（X4） |
4.45 |
5.00 |
6.00 |
7.00 |
7.55 |
|
蛋白腖（X7） |
1.65 |
2.20 |
3.20 |
4.20 |
4.75 |
|
MnSO4·H20（X11） |
0.55 |
0.69 |
0.94 |
1.19 |
1.32 |
|
表7 中心組合設計及其結果 | ||||||||||||
|
編號 |
變量水平 |
lg[Ns/(cfu/ml)] |
|
編號 |
變量水平 |
lg[Ns/(cfu/ml)] | ||||||
|
X3 |
X4 |
X7 |
X11 |
X3 |
X4 |
X7 |
X11 | |||||
|
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
9.36 |
15 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
9.39 | |
|
2 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
9.36 |
16 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
9.27 | |
|
3 |
1.547 |
0 |
0 |
0 |
9.28 |
17 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
9.24 | |
|
4 |
-1.547 |
0 |
0 |
0 |
9.27 |
18 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.31 | |
|
5 |
0 |
0 |
0 |
1.547 |
9.34 |
19 |
0 |
0 |
-1.547 |
0 |
9.30 | |
|
6 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
9.23 |
20 |
0 |
-1.547 |
0 |
0 |
9.46 | |
|
7 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
9.30 |
21 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.29 | |
|
8 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
9.20 |
22 |
0 |
0 |
1.547 |
0 |
9.37 | |
|
9 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.42 |
23 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.44 | |
|
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.43 |
24 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.20 | |
|
11 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
9.29 |
25 |
0 |
1.547 |
0 |
0 |
9.34 | |
|
12 |
1 |
1 |
1 |
1 |
9.20 |
26 |
0 |
0 |
0 |
-1.547 |
9.41 | |
|
13 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.34 |
27 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
9.36 | |
|
14 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
9.20 |
|
|
|
|
|
| |
|
表8 中心組合設計(CCD)回歸分析結果 | ||||||||||
|
回歸係數 |
參數估計 |
標準差 |
t |
P |
|
回歸係數 |
參數估計 |
標準差 |
t |
P |
|
Intercept |
9.434 |
0.015 |
638.810 |
0.000 |
Intercept |
9.434 |
0.015 |
638.810 |
0.000 | |
|
X3 |
-0.003 |
0.007 |
-0.391 |
0.702 |
X3X11 |
-0.012 |
0.007 |
-1.635 |
0.128 | |
|
X4 |
-0.025 |
0.007 |
-3.860 |
0.002 |
X4X11 |
-0.026 |
0.007 |
-3.491 |
0.004 | |
|
X7 |
0.028 |
0.007 |
4.282 |
0.001 |
X7X11 |
-0.030 |
0.007 |
-4.067 |
0.002 | |
|
X11 |
-0.013 |
0.007 |
-1.961 |
0.074 |
X3X3 |
-0.068 |
0.009 |
-7.672 |
0.000 | |
|
X3X4 |
-0.006 |
0.007 |
-0.855 |
0.409 |
X4X4 |
-0.013 |
0.009 |
-1.522 |
0.154 | |
|
X3X7 |
-0.020 |
0.007 |
-2.615 |
0.023 |
X7X7 |
-0.043 |
0.009 |
-4.891 |
0.000 | |
|
X4X7 |
-0.009 |
0.007 |
-1.257 |
0.233 |
X11X11 |
-0.025 |
0.009 |
-2.805 |
0.016 | |
|
表9 響應麵極值分析 | ||||||
|
臨界值 |
估計值 |
細菌總數Nt/(cfu/ml) |
穩定點模型 | |||
|
X3 |
X4 |
X7 |
X11 | |||
|
-0.03 |
-1.2 |
0.42 |
0.12 |
9.454 |
2.84×109 |
最大值 |
2.4、優化結果驗證
采用優化後的培養基與起始的種子培養基進行對照，並對培養條件進行優化，結果表明，優化後的培養基提高了各階段細菌總數的數量，在36h時，優化後培養基可以使細菌總數從 8.32×108cfu/mL提高到3.10×109cfu/mL，並且在36h時，芽孢率可以達到96%。
3、結論
通過 Plackett Burman設計、最陡爬坡試驗及中心組合設計的方法確定了B.subtilis MA139發酵培養的最適培養基。優化後B.subtilis MA139的細菌濃度為3.10×109cfu/mL，芽孢率達到96%從而有效的提高了單位產芽孢的數量
作者：郭小華 陸文清 鄧萍 黃德仕
作者單位：中國農業大學農業部飼料工業中心 中國農業大學農業部飼料工業中心 中國農業大學農業部飼料工業中心 中國農業大學農業部飼料工業中心
