微量稀釋法對腫瘤患者術後合並感染ESBLs菌株的檢測驗證

摘　要　目的：用新型微量稀釋法對腫瘤患者術後合並感染超廣譜β－內酰胺酶菌株進行檢測驗證。方法：雙紙片法初試微量稀釋法驗證，對27株肺炎克雷伯氏菌和32株大腸埃希氏菌進行超廣譜β－內酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,簡稱ESBLs）檢測。結果：顯示肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌ESBLs攜帶率分別為14.8％(4/27)和9.4％(3/32)。結論：微量稀釋法是一種新型的驗證方法，不但可以測ESBLs，還可以同時測多種頭孢三代類抗生素的MIC，具有不易漏檢，重複性好，準確，操作簡便，終點易於判斷的優點。

　　關鍵詞：超廣譜β－內酰胺酶　雙紙片法　微量稀釋法　肺炎克雷伯氏菌　大腸埃希氏菌

　　由質粒介導的超廣譜β－內酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,ESBLs）是一類水解底物譜相當廣泛的β－內酰胺酶。與以往常見的由質粒介導的TEM－1，TEM－2和SHV－1β－內酰胺酶不同的是這些ESBLs不僅能水解青黴素和一、二代頭孢菌素，還能水解常用的三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢三嗪、頭孢噻肟及氨曲南等，但不能水解頭黴素類如頭孢西丁和碳青黴烯類如亞胺配能等。近年來已發現能水解頭孢西丁的ESBLs，對產生這類酶的細菌目前尚缺乏簡單而又特異性高的常規檢測法，從而給臨床治療帶來一定困難^[1,2]。

　　目前常規體外藥敏試驗很容易造成ESBLs的漏檢，像常見的攜帶ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌在常規體外藥敏試驗中常對頭孢他啶、頭孢三嗪、頭孢噻肟及氨曲南敏感而臨床使用這些藥物治療感染性疾病時則常導致失敗^[2～4]。隻有使用ESBLs檢測方法才能檢測出細菌是否攜帶ESBLs，常用方法有雙紙片法，三維試驗，Etest等，需要設備的檢測方法像等電聚焦電泳法，分子生物學檢測法如限製性內切酶試驗、PCR技術、基因序列分析等。

　　為了解腫瘤患者術後合並感染細菌中ESBLs流行的情況，我們采用上述方法中通用而又簡便的雙紙片法篩選ESBLs陽性的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌，再用一種新型微量稀釋法進行驗證，現將結果報告如下。

　　1　材料與方法

　　1.1　菌株均為我院1997年3月～1997年12月期間從腫瘤患者術後合並感染菌株中分離到的肺炎克雷伯氏菌27株和大腸埃希氏菌32株。

　　1.2　菌株鑒定采用API係統鑒定（Biomerieux,法國）。

　　1.3　雙紙片法初篩試驗^[2]

　　選用羥氨苄西林加克拉維酸藥敏紙片（BBL），頭孢他啶，頭孢噻肟，氨曲南藥敏紙片（自製），按K－B法操作，將羥氨苄西林加克拉維酸紙片貼在MH平皿中央，用兩種平皿，一種距其20mm處（以紙片中心為準）等距離貼頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南藥敏紙片；另一種為距30mm處按上述方法貼紙片；經35℃孵育18～24小時後觀察結果，如發現有協同作用，即初步認定ESBLs陽性。質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯氏菌（WHO贈送），後者用來檢測克拉維酸是否失效。

　　1.4　ESBLs校正試驗微量稀釋法（金章醫用新技術研究所，天津），該方法采用微量48孔PVC平板進行頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南微量肉湯MIC測定（稀釋範圍均為0.25～30mg/L），以及上述三種藥物（稀釋範圍均為0.06～8mg/L）加克拉維酸組成（克拉維酸濃度為16mg/L）。具體操作方法為先將待測菌株用腦心浸液（Oxoid）增菌4～6小時，然後用麥氏比濁管0.5號進行菌液濃度校正，校正完畢用無菌0.85％鹽水稀釋100倍後，使用一次性接種器將菌液移種到48孔PVC平板中，最終菌液接種濃度為(0.5～1)×105CFU/L。將試劑盒置於35℃溫箱孵育16～18小時觀察結果。分別讀出頭孢他啶（CAZ），頭孢噻肟（CTX）和氨曲南（AZT）的MIC以及上述三種藥物加克拉維酸（CL）的MIC值，分別用CAZ，CTX，AZT的MIC值除以CAZ＋CL，CTX＋CL及AZT＋CL的MIC值，凡結果≥8者為ESBLs陽性。

　　2　結果

　　凡雙紙片法測ESBLs陽性的菌株，經用微量稀釋法證實均為ESBLs陽性，具體情況分析如下。

　　27株肺炎克雷伯氏菌對CAZ、CTX和AZT的耐藥率分別為14.8％、3.7％和7.4％。ESBLs檢測陽性率為14.8％(4/27)。其中同時耐三種抗生素的肺炎克雷伯氏菌有1株，其ESBLs檢測陽性。耐CAZ和AZT的細菌有1株，但ESBLs檢測為陰性。單耐CAZ菌有3株，其中1株ESBLs檢測陽性（圖1）。有2株肺炎克雷伯氏菌體外藥敏試驗顯示對CAZ、CTX和AZT均敏感，但ESBLs檢測陽性。

圖1　圖中顯示待測肺炎克雷伯氏菌對CAZ耐藥，

　　mIC＞32mg/L對CAZ/CL則由於協同作用

　　mIC=4mg/L兩者比值＞8說明ESBLs陽性

　　32株大腸埃希氏菌對CAZ、CTX和AZT耐藥率分別為15.6％，6.3％和9.4％。ESBLs檢測率為9.4％(3/32)。其中同時耐三種抗生素的大腸埃希氏菌有2株，均未檢測出ESBLs。同時耐CAZ和AZT菌有1株且ESBLs檢測陽性。單耐CAZ菌有1株，ESBLs檢測陽性，還有1株ESBLs陽性的大腸埃希氏菌體外藥敏試驗對CAZ、CTX和AZT均敏感。

　　在雙紙片初試中，發現用30mm間距有1株ESBLs陽性肺炎克雷伯氏菌看不到協同作用，用20mm間距紙片檢測，顯示明顯的協同作用（圖2,3）。

圖2　從圖中可以看出ESBLs陽性菌株由於距離較遠(30mm)

　　顯示陰性結果。平皿中央為羥氨苄西林/克拉維酸紙片。

　　周圍分別為頭孢他啶(上)頭孢噻肟(右)氨曲南(左)

圖3與圖2比較，同一ESBLs陽性菌株選用20mm距離顯示陽性結果，紙片之間出現協同作用

　　3　討論

　　目前引起世界重視的細菌耐藥機製之一就是ESBLs。許多國家如歐洲的德國、法國、英國等，亞洲的日本、韓國、印度以及美國等地區均先後發現達幾十種之多的ESBLs，且多存在肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌中，在法國攜有ESBLs肺炎克雷伯氏菌的比例1985年為0.75％，1987年為8.4％，1988年就上升到11％^[1,5]。本組剛開始此項工作就發現攜有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌的比例已高達14.8％，隨著抗生素的大量使用，這種升高趨勢仍將有所發展，值得臨床微生物工作者引起重視。

　　攜有ESBLs肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌給目前使用β－內酰胺酶類抗生素治療帶來了一定困難。有資料表明當這些菌株常規藥敏試驗證實對CAZ耐藥而對CTX或AZT敏感時，隨著接種菌量的增加CTX和AZT的MIC可以明顯增高。動物試驗證實在這種情況下CTX或AZT的治療將導致失敗^[6,7]。本文結果也顯示出攜有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌對CAZ、CTX和AZT大多呈敏感，隻有采取專用ESBLs測定方法才能將其檢測出來。

　　從國外資料來看^[2,4,8,9]，臨床檢測ESBLs常用的方法有雙紙片法、三維試驗、Etest等。盡管方法不同，但其基本原理一致，就是利用廣譜β－內酰胺類抗生素與β－內酰胺酶抑製劑如克拉維酸的協同作用有無來判斷細菌是否攜帶ESBLs。Jarlier等^[8]建議在雙紙片法中羥氨苄西林加克拉維酸紙片與頭孢三代類抗生素紙片之間的距離以30mm為宜。也有的學者提出當以30mm間距為準的雙紙片法陰性時可改用20mm間距為準的雙紙片法重複一次^[4]。基於上述觀點，我們采用兩種間距同時進行，發現當ESBLs陽性菌對頭孢三代類抗生素高度耐藥無抑菌圈或很小時，用30mm間距的紙片就無法測出ESBLs，而用20mm間距就很易測出ESBLs。反之如果頭孢三代類抗生素的抑菌圈較大，則20mm間距相對就會造成抑菌圈過度重疊而不易看出協同作用，這時使用30mm間距的雙紙片法就很易看出是否有協同作用，所以我們認為在檢測未知菌是否攜帶ESBLs時應該兩種間距同時進行，既提高ESBLs檢出率又可縮短患者等待時間，有利於臨床醫生及時合理使用抗生素。

　　表1，2示Etest采用CAZ和CAZ＋CL在同一個試條上進行檢測，該方法操作簡便，可同時測出檢測菌的最低抑菌濃度（MIC）和ESBLs。缺點是該試紙條隻有一種抗生素即CAZ，這樣對CAZ高度耐藥或MIC小於0.5的產ESBLs菌株，若用該方法可能檢測不出來。相比之下微量稀釋法不僅能同時檢測多種頭孢三代類抗生素如CAZ、CTX和AZT和MIC，而且還能用上述三種頭孢菌素加克拉維酸同時檢測ESBLs，由於三種頭孢菌素對檢測菌的MIC值不盡相同，當一種抗生素由於MIC值過高或過低不能測出ESBLs時，另外兩種抗生素就可能剛好測出ESBLs，以資進行互補，彌補了隻用一種抗生素所造成的漏檢，可明顯提高ESBLs檢出率，本實驗也證實了這一點。

表1　微量稀釋法對4株肺炎克雷伯氏菌ESBLs陽性檢測結果

　　CAZ:頭孢他啶CAZ＋CL:頭孢他啶＋克拉維酸CTX:頭孢噻肟CTX＋CL:頭孢噻肟＋克拉維酸

　　aZT:氨曲南AZT＋CL:氨曲南＋克拉維酸

表2微量稀釋法對3株大腸埃希氏菌ESBLs陽性檢測結果

　　微量稀釋法操作非常簡便，省時省力，重複性好，終點很易判斷，但克拉維酸在冰凍液體條件中保存的有效時間較紙片短，因此，使用時應定期進行檢測，以免失效，影響結果。

作者單位：天津醫科大學附屬腫瘤醫院細菌室（天津市300060）

　　參考文獻

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　　9 Thomson KS,Sanders CC.Detection of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterbacteriaceae:comparison of the double-disk and three-dimensional test.Antimicrob Agents Chemother,1992;36:1887

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