產空泡毒素幽門螺杆菌感染的臨床意義

幽門螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍和萎縮性胃炎的重要病因之一，並與胃癌、胃淋巴瘤的發生密切相關，其中人群中的感染率超過50％，目前已被世界衛生組織列為一級致癌因子^〔1〕。Hp的致癌因子包括：尿素酶、脂多糖、熱休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)等。其中VacA蛋白僅有部分菌株產生，可引起上皮細胞出現空泡樣變及胃粘膜病變。為了解重慶地區HpVacA＋株的感染與不同消化道疾病的關係，我們采用ELISA法和細胞培養法，檢測了本校西南醫院消化科住院患者HpVacA＋株感染的情況。

　　1　材料和方法

　　1.1材料Hella細胞與Hp標準產毒株為本室保存。包被用VacA為本室基因工程表達產物。MeM細胞培養液為Gibico公司產品。辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG)購自華美公司。酶標儀為Beckman公司產品。

　　1.2方法

　　1.2.1Hp菌的分離培養取消化病患者的胃粘膜標本48人份，並同時抽取外周血分離Hp菌。首次分離時，采用牛心、腦浸液固體培養基，於微需氧條件下37℃培養48h，做革蘭氏染色觀察形態，並做尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶試驗鑒定Hp菌。常規分離血清，置20℃凍存待用。

　　1.2.2Hp菌VacA的活性檢測①分離Hp菌及VacA的收集，參照文獻〔2〕進行。②用MeM細胞培養液(含150mL/L小牛血清和100kU/L青、鏈黴素雙抗)，於37℃70mL/LCO2條件下培養Hella細胞，至計算數達10⁸/L以上。加於96孔細胞培養板中，每孔100μL，並加入100μLVacA，於37℃70mL/LCO2條件下培養18～24h。每份樣品做倍比稀釋(1∶10，1∶20～1∶160)，每個稀釋度測定2次。空白對照孔中加入100μLHp液體培養基上清代替Hp菌培養物的超濾上清。於光鏡下計數Hella細胞的空泡樣變，細胞空泡形成≥50％者判為陽性。

　　1.2.3外周血清中抗VacA抗體的檢測采用ELISA夾心法，操作步驟及結果判定均按照文獻〔3〕進行。簡要過程是：以基因工程製備的VacA蛋白包被酶標板(100mg/L)，依次用牛血清白蛋白封閉，加入Hp感染患者的血清和HRP羊抗人IgG，用OPD顯色後，檢測A405nm值。結果判定：測試孔A405nm值－空白孔A405nm值/陰性對照孔A405nm值－空白孔A405nm值≥2.1者判為陽性。另將Hp產毒標準株超聲粉碎後，以12000×g40℃離心20min。取上清包被作為陽性對照，以VacA稀釋液包被作為陰性對照。

　　2　結果

　　從48例消化病患者胃粘膜及外周血中，共分離出Hp菌42株。分離菌VacA的活性檢測表明，約有62％的菌株可產生VacA；用ELISA法檢測抗VacA抗體的陽性率為45.8％。不同疾病患者的標本中分離的Hp產毒株的陽性率及不同Hp菌感染患者標本產生VacA的活性，以及血中抗VacA抗體的滴度均不相同，結果見表1。

表1不同疾病患者標本中分離的Hp產毒株

　　3　討論　　本研究證實，Hp菌的培養上清可誘導Hella細胞空泡形成，其產毒素株的陽性率為62％，與Leunk等^〔2〕的報道相似。抗VacA抗體的檢出，可間接說明不同Hp菌株產生的VacA的活性有差異。消化性潰瘍、胃癌患者感染Hp產毒株的陽性率和抗VacA抗體的檢出陽性率高於慢性胃炎組(P∨0.01)，提示VacA與較嚴重的胃粘膜病變有關。

　　VacA是一種相對分子質量(Mr)為87000的蛋白質，由Mr為136000的前體水解而形成。其對胰蛋白酶敏感、不耐熱，可引起組織細胞出現空泡和變性環死。Atherton等^〔4〕發現，VacA基因有3種不同的信號區和2個不同的中間區(S1a，S1b，Si，m¹和m²)，其等位基因有5種重組體(sla/m1，sla/m²，slb/m¹，slb/m²和s²/m²)。其中隻有s1/m¹產生的VacA活性高；而s²/m²株幾乎測不到細胞毒性，說明VacA的表達及活性與其基因亞型有關。臨床上發現，約有60％Hp可產生VacA，也是由於VacA基因亞型的不同所致。本實驗中，抗VacA抗體的陽性率低於Hp菌的感染率，也說明不同基因亞型產生的VacA活性不同，誘發機體產生免疫應答的程度不同所致。Timothy等^〔5〕對VacA蛋白的N端氨基酸序列分析發現，VacA與大腸杆菌K⁺－Na⁺ATP酶的β鏈、人K＋－Na＋ATP酶的α亞單位及人胃K⁺－Na⁺ATP酶的α亞單位等離子通道或轉運蛋白部分同源。由於胃酸的分泌是由壁細胞H⁺－K⁺ATP酶所介導，因此，VacA可能通過作用於壁細胞中的H⁺－K⁺ATP酶而影響胃酸的分泌，從而使Hp菌逃避胃酸對其損害，定植於胃粘膜上。另外，細胞膜內外K⁺－Na⁺濃度的維持需K⁺－Na⁺ATP酶；而K⁺－Na⁺濃度的變化又可通過影響細胞中細胞器的毒素係統而導致VacA異常分泌，引起上皮細胞空泡樣改變。VacA誘導上皮細胞空泡樣改變的機製，可能是幹擾了細胞膜內外K⁺－Na⁺的正常轉運，使膜內外K⁺－Na⁺濃度發生異常變化而導致VacA異常釋放。

　　VacA在Hp致病性中的作用，尤其是其與消化性潰瘍及胃癌的關係已引起眾多學者的重視。早期診斷並消除VacA⁺株感染，可大大降低消化性潰瘍和胃癌的發病率。進一步闡明VacA蛋白的結構、功能及其致病機製，對Hp與胃炎、消化性潰瘍和胃癌的病因學關係，以及對Hp感染的選擇性治療都將有十分重要的意義。另外，還可研製VacA佐劑疫苗，通過消除Hp感染，治療消化性潰瘍和預防胃癌的發生。

　　作者簡介:魯東水，男，36歲，實驗師重慶市高灘岩，Tel.(023)68752315

　　參考文獻：

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　　〔3〕 Easton KA, Brooks CL, Morgan DR, et al. Serology detection of antibodies to Helicobacter pylori in children and adolescents using ELISA〔J〕 . Infect Immun, 1991; 59: 2470－ 2475.

　　〔4〕 Tummuru MKR, Cover TL, Blase MJ. Cloning and expression of a high molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production〔J〕 . Infect Immun, 1993; 61: 1799.

　　〔5〕 Cover TL, Tummuru, MKR, Cao P, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori〔J〕 . J Biol Chem, 1994; 269: 10566.

　　〔6〕 Atherton JC, Ping C, Peek PM, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains〔J〕 . J Biol Chem, 1996; 270: 17771.

　　〔7〕 Timothy L, Cover TL, Martin JB, et al. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori〔J〕 . Am J Biol Chem, 1992; 267:10570－ 10575

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