白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡的基因調控

摘要 ： 目的　探討白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡過程中的基因調控作用。方法　經小鼠尾靜脈注射白色念珠菌後，采用FCM技術測定胸腺凋亡細胞上5個凋亡相關基因(p53,bax,bcl-2,fas和 c-myc)產物的水平在不同時間組的變化。結果　p53和bax兩個基因產物的水平明顯增加 ； 而bcl-2， fas和c-myc基因產物的水平無明顯改變。結論　白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡，可 能是經由基因調控的轉錄途徑機製而發生,p53和bax基因在此過程起重要作用。

　

　　Abstract: Aim To investigate the gene regulation effect during the thymocytes' apoptosis induced by candida albicans. Methods FCM technique was adopted to monitor changes of five apoptosis associated genes in various time groups after intravenous injection of Candida albicans via mouse' tail. Results The dynamic observations displayed that gene product levels of p53 and bax increased significantly, while that of bcl-2, fas and c-myc revealed no statistic changes. Conclusion Candida albicans induced apoptosis of thymocytes in mice is possibly gene regulated by transcriptional pathway, and p53 as well as bax play an important role in this process.

　　Keywords： Candida albicans； thymocyte; apoptosis; gene regulation ▲

　　臨床上，白色念珠菌(C.albicans)引起的醫源性感染是住院患者發病和死亡的一個重要原因。我室以前的研究表明，靜脈感染白色念珠菌能引起小鼠胸腺萎縮和胸腺細胞凋亡,且呈濃度和時間依賴性,同時伴有外周血淋巴細胞數量的減少^〔1〕。采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL)研究發現，小鼠胸腺內凋亡細胞主要分布在胸腺皮質，髓質也有少量分布。經流式細胞術(flowcytometry,FCM)對小鼠胸腺懸液中細胞的表型測定發現，CD3＋CD4＋CD8＋T細胞的數量隨時間而顯著減少。這些結果提示，白色念珠菌能誘導小鼠皮質胸腺細胞凋亡，但有關白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡基因調節的研究，目前國內外未見報道。我們試圖從基因水平上，闡明白色念珠菌誘導小鼠皮質胸腺細胞凋亡的機製，並采用FCM動態觀察了5個凋亡相關基因(p53,bax,bcl-2,fas和c-myc)產物的水平，以及在白色念珠菌誘導小鼠皮質胸腺細胞凋亡的不同時間組中的變化。結果發現，p53和bax兩個基因產物的水平明顯增加；而bcl-2，fas和c-myc基因產物的水平無明顯改變。

　　1　材料和方法

　　1.1材料健康雌性4wk齡昆明種小鼠,體重14～16g,常規飼養(由本校實驗動物中心提供)。小鼠隨機分成兩大組：一組經尾靜脈注射0.2mL生理鹽水作為對照組，另1組注射4×106白色念珠菌作為實驗組；再根據觀察時間的不同，又將各大組分為5個不同的時間組,即2,6,12,18和24h5個組。

　　1.2方法

　　1.2.1白色念珠菌的製備及胸腺細胞凋亡的測定

　　將白色念珠菌ID16V1株(中國科學院菌種保存中心提供)按文獻〔2〕處理,使98％白色念珠菌形成菌絲型,調整至2×1010/L的濃度。提取DNA及凝膠電泳，參照文獻〔3〕的方法進行。

　　1.2.2凋亡細胞及凋亡調控基因產物的檢測按文獻〔4〕的方法，取胸腺單個細胞懸液滴入預泠的700mL/L乙醇中,搖勻固定細胞,做細胞核DNA熒光染色(PI)和FCM分析，每個樣本分析104個細胞,觀察G1峰前是否出現特征性凋亡峰,並計算凋亡細胞的百分率。另取已固定的胸腺細胞(1×106)，用PBS洗兩次(1800rpm,5min)，分別加入小鼠抗p53,抗bax,抗bcl-2,抗fas和抗c-myc單克隆抗體(mAb)(美國Maco公司產品)，37℃孵育30min，PBS洗兩次,加入羊抗鼠FITCIgG(美國Maco公司產品)，同上孵育、洗滌，用FCM檢測相應基因產物的水平。測定的數據經BDISConsort30VerE計算機軟件處理，基因產物的水平用熒光道數(channelnumber)表示。

　　實驗結果采用χ-±SE表示，多組間的比較用單因素方差分析,顯著性差異以P>0.05為準。

　　2　結果

　　2.1小鼠胸腺凋亡細胞的百分率小鼠經尾靜脈注射4×106白色念珠菌，於2，6，12，18及24h後，分別處死小鼠，取胸腺細胞製成懸液進行FCM檢測(圖1)。除2h實驗組未出現胸腺凋亡細胞百分率的改變外，其餘幾組的細胞凋亡百分率與對照組相比較均顯著上升(P>0.05)。

　　2.2小鼠胸腺細胞凋亡的生化改變經小鼠尾靜脈注射白色念珠菌(4×106)後，對12，18和24h實驗組的胸腺細胞基因組DNA進行電泳，均出現典型的DNA梯形帶(圖2)。

　　2.3小鼠胸腺細胞凋亡基因產物水平的變化用FCM對對照組及不同時間實驗組小鼠胸腺細胞懸液中，單個細胞基因表達產物的水平進行了分析。結果表明，p53基因產物的水平2h組無改變，而6h組已增加很明顯，12h組達高峰，18h組出現回落，24h組又回升。bax基因表達產物的水平在2h和6h組均無明顯改變,而12h組增加明顯,18h組達高峰，24h組有所回落，但bcl-2,fas和c-myc基因產物的水平與對照組相比較均無明顯的變化(P>0.05，表1)。

　　圖1白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡的變化(％)

　　aP∨0.05vsCtrl;bP∨0.001vsCtrl.bdP∨0.01vs12group.

　　Fig 1 Changes of apoptotic cells in C. albicans induced apoptosis of murine thymocytes(％ )

圖2白色含珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡的基因調控

　　表1　白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡中5種基因產物水平的變化

　　

　　目前所知，促進胸腺細胞凋亡的基因有p53,Nur77,c-myc,fas和fasL等,而bcl-2基因則有抑製胸腺細胞凋亡的作用。值得注意的是，細胞凋亡可經由不同的信號傳導途徑而發生,因此，不同誘因所致凋亡過程中基因的表達也不盡相同。我們應用FCM分析了5個與細胞凋亡有關的基因,發現白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡的相關基因主要為p53和bax。結果顯示，雖2h實驗組胸腺細胞未發現p53基因產物的水平有改變，但6h實驗組已出現很明顯的增加(P>0.01),推測p53基因轉錄的實際時間要大大早於6h組。從凋亡的百分率看，2h實驗組無明顯變化,而6h組的凋亡細胞數雖有明顯增加(P>0.05)，但此時p53基因產物的水平增加得更多(P>0.01),提示p53基因產物的增加要先於細胞凋亡百分率的增加,因此，胸腺細胞的凋亡可能是通過轉錄途徑而發生的。p53基因產物於6h出現很明顯的增加,12h達高峰，18h有所下降，24h有所回升,與bax基因產物的改變(18h達高峰，24h有所回落)相比較,提示p53基因的表達早於bax基因，且兩者共同作用於白色念珠菌誘導的小鼠胸腺細胞凋亡。但p53可能作用於細胞凋亡的早期，bax作用於凋亡的晚期；或是p53基因通過提高bax基因的轉錄，使bax/bcl-2的比值增高而進一步促進細胞凋亡^〔5，6〕。有文獻報道，γ射線照射小鼠後，小鼠胸腺細胞中p53基因表達產物的水平顯著增加，並維持48h^〔7〕；而且該基因能上調bax基因的表達和下調bcl-2基因的表達^〔8〕。bcl-2與bax屬同源基因,但它們的作用恰好相反，bcl-2必需結合bax才能發生效應,bcl-2與bax表達的比值決定細胞是否發生凋亡^〔5，6〕。本實驗結果顯示，胸腺bax基因的產物增加，而bcl-2基因的產物基本保持不變(稍有下降但無統計學意義)，推測可能是bax/bax同源二聚體的比值大於bcl-2/bax異源二聚體的比值^〔5，6〕，而促進胸腺細胞凋亡。至於fas和c-myc基因的作用還有待於進一步研究。雖然fas基因的產物在6h和12h組均有上升,c-myc基因產物在12h組有上升,但無統計學意義。這有可能表明，fas和c-myc基因的確未參與白色念珠菌誘導的小鼠胸腺細胞凋亡的過程,也可能因為我們未能捕捉到兩基因表達水平的最高點。有文獻報道，胸腺內的克隆消除，在bcl-2基因缺失小鼠和不表達fas基因的lpr/lpr小鼠中均有發生,提示bcl-2和fas基因在克隆消除中，並非處於主導地位^〔9〕。由此我們推測，白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡主要是經由基因調控的轉錄途徑機製而發生，且p53和bax基因在此過程起著重要的作用。

　　

作者：陳欲曉　韋超凡

單位：陳欲曉（湖南醫科大學免疫學教研室，湖南長沙 410078）；韋超凡（湖南醫科大學免疫學教研室，湖南長沙 410078

 

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