【摘要】 目的 對臨床耐多藥誌賀菌株H24的1種小多重耐藥性家族(SMR)外排泵emrE基因進行定向分子進化，研究基因突變增強emrE外排泵耐藥性的潛力，調查誌賀菌外排泵基因emrE基因垂直進化對臨床耐藥發展的影響。 方法 通過用體外易錯PCR(EP-PCR)方法對emrE基因進行隨機突變實驗，用微量稀釋生長曲線法進行菌株的耐藥性篩選，用熒光實時定量RT-PCR測定基因表達情況，應用DNA分析軟件DNAStar進行生物信息學分析。結果 在31個突變子中篩選到了突變子ep2-emrE(DH5α)，它的emrE基因有6個氨基酸突變, 分別為Thr-28→Ala，Cys-39→Ser，Tyr-40→終止子， Ser-72→Arg，Leu-93→Phe，Ile-101→Phe。它不但增強四環素和紅黴素的耐藥能力，還產生新的氯黴素耐藥能力。結論盡管emrE基因較易獲得新增耐藥性，但在誌賀菌對四環素、紅黴素等抗生素耐藥性發展中，emrE基因的進化突變沒有被篩選，表明有其他能力更強的耐藥基因在突變進化中起作用。
【關鍵詞】 誌賀菌;耐藥性;emrE基因;分子進化
Effect of genetically modified efflux pump emrE in isolated Shigella spp. WU Jian, MU Ruirui, REN Cunbang, et al.College of Public Health ,
Abstract： Objective To study the potential gene mutation increasing the drug resistance ability of emrE efflux pump via genetic modification of the emrE gene from clinical isolated Shigella spp. strain H24, and to investigate the relationship between clinical drug resistance development of Shigella spp. and the vertical evolution of emrE efflux pump. Methods Gene emrE was mutated via error prone PCR.Drug resistance of the strain was determined by microdilution growth curve method.The expression of the genes was measured by fluorescent quantitative RTPCR and the bioinformatics analysis was conducted by DNAStar. Results Among the 31 mutants, ep2emrE showed the ability of increasing tetracycline and erythromycin resistance and the newly gained ability of chloromycetin resistance indicating the mutational potent of the gene. Conclusion Although it is easy for gene emrE to achieve new drug resistant ability, the mutation and vertical evolution of the emrE gene is not selected in the development of tetracycline and erythromycin resistance.So,there may be some more strong multidrug resistance genes and mutation.
Key words： Shigella spp.; drug resistance; emrE gene; molecular evolution
細菌的藥物外排作用是近10年發現的重要耐藥機製，它在細菌中廣泛存在〔1〕。一種外排泵可排出結構完全不相幹的多種藥物，因而可造成耐多藥性。對大腸埃希菌基因組的調查顯示，至少存在37種外排泵，包括耐單藥和耐多藥外排泵，分屬5個外排泵家族〔2〕。耐多藥誌賀菌H24的emrE外排泵是一種最簡單的外排泵，屬於小多重耐藥性家族(small multidrug resistance, SMR)，也是一種研究最充分的耐多藥外排泵。它可以表達對一價陽離子及親脂性陽離子如紅黴素、磺胺噻唑鈉、四環素、磺胺嘧啶鈉、溴乙啶和結晶紫的耐藥性〔3〕。本研究通過體外隨機突變獲得突變體，對emrE基因垂直進化進行研究，獲得了耐藥功能增強和新的耐藥功能的突變基因，並探討了該基因的突變對細菌耐藥能力進化的影響。
1 材料與方法
1.1 材料 (1)菌株：大腸埃希菌DH5α，臨床分離誌賀菌耐多藥株H24(鄭州大學公共衛生學院流行病教研室收集保存); (2)載體：pMD18-T 載體(寶生物大連有限公司);(3)工具酶及試劑：SacⅠ內切酶、BamHⅠ內切酶、胰RNA酶、DNA 回收試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光擴增體係(寶生物大連有限公司);抗生素(中國藥品生物製品檢定所);酵母提取物和蛋白腖(英國Oxiod公司)。營養肉湯水解酪蛋白培養基(MH)(北京奧博星公司)。
1.2 方法
1.3 生物信息學分析 肽鏈序列比對分析由DNASTAR Inc.的 DNAStar Lasergene軟件處理。
2 結 果
2.1 EP-PCR擴增(圖1) 經過條件摸索和優化，2次EP-PCR(epA,epB)擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均在約1100 bp處有一特異擴增條帶，分子量大小與預期擴增值相符。將EP-PCR擴增產物與pMD-18T載體連接，並轉入DH5ɑ菌株進行篩選，共得到31株重組株。提取質粒酶切電泳檢測後，送樣測序。
注：M:DL2000 Marker; 1,2：epA-emrE; 3：epB-emrE。
圖1 EP-PCR擴增產物凝膠電泳分析
2.2 菌株的耐藥性變化(圖2) 選用不同EP-PCR變異株 pMD- ep1-emrE(DH5ɑ)和pMD- ep2-emrE(DH5ɑ)，通過微量稀釋生長曲線法測定這2株進化菌株及出發基因對照株pMD-emrE(DH5ɑ)和空質粒對照株pMD (DH5α)對利福黴素、紅黴素、硫酸新黴素、四環素、氯黴素、環丙沙星和強力黴素的耐藥性。從生長曲線可以看出，pMDep2emrE(DH5ɑ)菌株對四環素、紅黴素和氯黴素的抗性比含原始基因株pMD-emrE(DH5ɑ)增高，其中氯黴素為新獲得的耐藥性, 表明經進化突變的ep2-emrE基因外排活性增強。圖2 pMD-epl-emrE(DH5ɑ)和pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)耐藥性變化2.3
重組菌株中EP-PCR emrE基因表達 為近一步確認突變基因的表達情況，對重組菌中emrE 基因的表達進行實時熒光定量反轉錄分析。在溶解曲線中未檢測到引物二聚體和其他非特異性熒光信號。熒光實時定量RT-PCR獲得pMD(DH
2.4 ep1-emrE、ep2-emrE的序列分析和氨基酸序列同源性比對 對原始emrE和突變基因ep1-emrE、ep2-emrE的DNA測序結果用DNASTAR
3 討 論
本研究結果表明，在31個突變子中篩選出的突變子ep2-emrE，不但有增強的四環素和紅黴素耐藥能力，還有新產生的氯黴素耐藥能力, 顯示這種外排泵基因具有突變增強耐藥性的潛力。根據本研究前期結果〔5〕分析，本研究結果尚不能表明這種外排泵基因在臨床誌賀菌對四環素、紅黴素等的耐藥性的發展中起著重要作用。原因為：(1)通過對emrE基因的係統發育分析表明，它有很強的進化規律和保守性，在不同種屬中有很強的歸屬性，與個體耐藥性無關;(2)本實驗所用誌賀菌H24是2002年在江西省銅鼓縣分離得到的臨床耐藥株，其emrE基因與20世紀50年代在北京分離的宋氏誌賀菌Ss046基因序列竟然完全一致〔5〕，說明50年來誌賀菌紅黴素和四環素耐藥性的迅速發展與emrE基因突變沒有關係。
實驗結果表明，在細菌中有一個強大的耐藥基因武器庫，新的藥物環境會進化篩選出新的改進型耐藥基因。在誌賀菌H24中，可能還有更強的紅黴素、四環素耐藥基因和耐藥突變在起作用。因此，象emrE基因這樣耐藥能力較弱基因的突變在臨床上未被篩選。在誌賀菌中起作用的紅黴素、四環素耐藥基因還待進一步研究。
作者：吳健 穆瑞瑞 任存邦 王春陽 李玨 張衛東 範清堂 段廣才
【參考文獻】
〔1〕 Piddock LJ.Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J].Clinical Microbiology Review,2006,19(2):382-402.
〔2〕 Nishino K,Yamaguchi A.Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli[J].J Bacteriol,2001,183 (20): 5803-5812.
〔3〕 Sharoni M,SteinerMordoch S,Schuldiner S.Exploring the binding domain of emrE,the smallest multidrug transporter[J].J Biol Chem,2005,280(38):32849-32855.
〔4〕 吳健，張少平，任存邦，等.誌賀菌外排泵cmr基因克隆及耐藥作用[J].中國公共衛生,2007,23 (12): 1494-1495.
〔5〕 吳健,張少平，穆瑞瑞，等.誌賀菌外排泵基因 emrE 的克隆表達及進化分析[J].中國抗生素雜誌，2007,32(10): 621-626.
〔6〕 Eggertsson G,Sll D.Transfer ribonucleic acidmediated suppression of termination codons in Escherichia coli[J].Microbiological Reviews,1988,52(3)：354-374.
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