檸檬醛抗真菌及抑製黃曲黴產毒的試驗報告

摘要：采用平板法比較了檸檬醛與合成食用防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀對5種黴菌和5種酵母菌的抗菌效力。結果表明，在培養基pH4.5時，檸檬醛對多數試驗真菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.10％～0.15％，與山梨酸鉀的抗菌效力相近，優於苯甲酸鈉。在添加0.15％檸檬醛的麥芽汁搖床試驗中發現，魯氏酵母生長曲線的調整期比對照組延長，對數生長期和穩定期縮短，細胞總數減少了55％。同時，檸檬醛與黃曲黴產毒關係的試驗顯示，檸檬醛對黃曲黴產生黃曲黴毒素具有較強的抑製作用，可以減少81％以上的毒素產生。
關鍵詞：檸檬醛；真菌；抗菌效力；黃曲黴毒素
前言
　檸檬醛係香葉醛(反式甲位檸檬醛，geranial)和橙花醛(順式乙位檸檬醛，neral)的混合物，無色或微黃色液體，呈濃鬱檸檬果香味，是我國允許使用的食品增香劑[1]，而且它還是合成紫羅蘭酮係列高級香料的重要原料。檸檬醛有天然品及人工合成兩種。天然檸檬醛存在於山蒼子油、檸檬草油、檸檬油、白檸檬油、柑桔類葉油等許多種芳香植物的精油中，其中山蒼子精油是檸檬醛的最主要來源。山蒼子主產於我國長江流域以南及東南亞地區，我國是山蒼子精油的最大生產國。
　餘伯良(1998)報道，山蒼子精油對多種黴菌具有抗菌性，而且對黃曲黴產生黃曲黴毒素有較強的抑製作用。檸檬醛是山蒼子精油的最大組分，含量為66％～80％。因此，有必要研究檸檬醛是否抗真菌及其與黃曲黴產毒的關係。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種黃曲黴(Aspergillusflavus)，桔青黴(Penicilliumcitrimum)，總狀毛黴(Mucorracemosus)，禾穀鐮刀黴(Fusariumgraminearum)，黑根黴(Rhizopusnigricans)，魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)，啤酒酵母(Sacch.ceravisiae)，粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)，浮膜假絲酵母(Candidamycoderma)，異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)。
　菌種中的黃曲黴、總狀毛黴係自製花生醬在28～32℃下敞開放置7d，從表層黴菌中分離、鑒定的主要兩株黴菌。其中黃曲黴為產毒菌株，該試樣用層析法[3]檢測，其黃曲黴毒素B1(AFTB1)含量為5.87mg/kg。其他菌種來源於中科院微生物所和成都生物所，由本院菌種室提供。
1.1.2試劑檸檬醛：采用真空分餾的單離方法從山蒼子油中提取，質量符合FAO/WHO(1981)標準(山蒼子油購自成都香料總廠，質量符合ISO3214－1974(E)標準；
　1，2—丙二醇、苯甲酸鈉及山梨酸鉀均為AR級，矽藻土cp級；
　AFTB1標準溶液：購自國內貿易部穀物油脂化學研究所標準室，濃度為1.00ug/mL；
　檢測AFTB1的矽膠薄層層析法所使用的儀器和試劑符合GB8381－87標準要求。
1.1.3培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA瓊脂)培養基和麥芽汁培養基。
　花生察氏培養基，配方如下：蔗糖30.0g、K₂HPO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaNO₃3.0g、KCl0.5g、FeSO₄0.01g、ZnSO₄0.4mg、花生水抽提液1000mL及瓊脂15.0g，調節pH至5.5(添加ZnSO40.4mg/L對產黃曲黴毒素有促進作用)。
　花生水抽提液製法：挑選新鮮、無黴花生仁200g，浸泡6h，加蒸餾水1200mL，先後用磨漿機、膠體磨研磨成乳漿狀，然後用多層紗布過濾，濾紙抽濾，取其濾液1000mL備用(若不足1000mL，須補充蒸餾水至足量)。
1.2方法
1.2.1平板法測檸檬醛的最低抑菌濃度(MIC)　將檸檬醛和苯甲酸鈉、山梨酸鉀分別用無菌丙二醇和無菌蒸餾水稀釋成9.0％、8.0％、7.0％至1.0％共9個重量百分比濃度梯度備用。
　分別挑取經PDA和麥芽汁瓊脂活化培養的上述5種黴菌孢子和酵母菌，用無菌生理鹽水製成混懸液(黴菌孢子濃度約為1×10⁶個孢子/mL，酵母菌液濃度約為3×10⁵個/mL)。作塗菌用，須在24h內使用。
　分別調節PDA瓊脂和麥芽汁瓊脂培養基，分裝於若幹支試管中(每支19mL)。滅菌後待降溫至60℃左右，分別吸取檸檬醛、苯甲酸鈉、山梨酸鉀三種試劑的稀釋液1mL加入各自試管中，充分搖勻，於50℃左右倒置平皿，含每種試劑的兩種培養基各倒27付(摻入相同濃度同一試劑的同種培養基倒置3付平皿，9個濃度梯度則為27付)。另外3支PDA瓊脂和3支麥芽汁瓊脂試管各裝培養基19mL，不摻入試劑，分別加入1mL丙二醇溶劑，搖勻後倒置平皿作對照(每次試驗用對照皿2個，PDA和麥芽汁瓊脂各一皿)。
　在每個平皿底部外麵用記號筆畫“大”字，並作標記。同種試劑相同濃度的兩個培養基平皿共接5種黴菌和5種酵母菌(每種菌分別塗在“大”字的5個空隙位置上，切忌混菌汙染)。對照組也塗菌，也是兩皿塗10種菌。28℃培養48h，觀察結果，以肉眼看不到酵母菌菌落、黴菌菌絲生長的最低試劑濃度為該試劑的MIC(做3次平行試驗，以2次或3次相同結果的為準)。
1.2.2檸檬醛對酵母細胞生長繁殖影響試驗酵母菌是單細胞，可以通過生長曲線的變化來考察檸檬醛對其生長繁殖的影響。我們以魯氏酵母為例，采用恒溫搖床培養，光電比濁法測定OD值(代表增殖細胞總數)，以及美蘭染色血球計數板法(測定活細胞)相結合，繪製魯氏酵母在添加了0.15％檸檬醛的培養基和空白條件下各自的生長曲線。主要步驟如下：
　①將澄清的麥芽汁加水稀釋成10°Bx′麥芽汁培養基，自然pH，分裝於9個300mL的具有側臂試管的三角燒瓶中，每瓶裝38mL，常規滅菌。其中3瓶為試驗組，添加0.15％檸檬醛(即魯氏酵母MIC低一個濃度梯度)試劑2mL；另外3瓶為不添加任何試劑的試驗對照組(在培養基中加入2mL無菌丙二醇)；剩下的3瓶作為測定光密度(OD值)的空白對照。
　②試驗組和試驗對照組每瓶均接種搖勻的酵母菌液4mL，置於台式萬能搖床中，28℃恒溫振蕩培養。開始時將剛剛接種的培養液搖勻後傾入側臂試管中，置於自製的“721”分光光度計比色管架上，用721型分光光度計測定菌液(細胞總數)濃度(光密度值)，此時所測讀數為“0”時讀數值(即接種量)。之後，在恒溫振蕩培養過程中每隔5h用相同方法測OD值，共測14次，至培養70h為止。比色時，均用無菌的相同培養液作空白對照，予以校正。用560nm波長測定。三次平行實驗，求其平均值。
　另外，用顯微鏡測微尺測定試驗組和對照組對數生長期酵母細胞大小，隨機各測5個細胞，取其平均值。
1.2.3檸檬醛與黃曲黴產毒關係試驗參考“培養皿中熒光反應法”，首先做檸檬醛是否抑製黃曲黴產毒的定性試驗。具體做法是：將花生察氏培養基溶化，分別放入若幹支試管中(每支19mL)，待降溫至60℃左右，各自加入1mL用丙二醇稀釋的不同濃度的檸檬醛(體積百分比濃度分別為5.0％、4.0％、3.0％、2.0％、1.0％)，每種濃度加3管。作對照的3支試管僅加入19ml花生察氏培養基和1mL丙二醇。各試管搖勻，緩緩傾入矽藻土薄層平皿中。接種黃曲黴，28℃培養6d後於125W紫外燈下觀察(濾光片波長365nm)，如果菌絲體上顯現亮藍紫色熒光則表示有黃曲黴毒素產生(作3次平行試驗，以2次或3次相同結果的為準)。選取各試劑陽性平皿中最具代表性的一個平皿(即菌絲生長與對照皿相近，而熒光反應卻比對照皿弱的)及丙二醇對照樣本，用矽膠薄層層析法分別測定各陽性皿及對照皿中培養基的AFTB1含量。各測2次，取其平均值。
2結果與討論2.1檸檬醛與合成食用防腐劑的MIC值比較　MIC值越低，表明相應試劑的抗菌效力越強。從表1可知，檸檬醛對10種試驗菌(5種黴菌和5種酵母菌)中的7種其MIC值為0.10％～0.15％，其抗菌效力與公認較好的合成食用防腐劑山梨酸鉀相近，而優於苯甲酸鈉。從檸檬醛對黴菌、酵母菌抗菌效能總體看，檸檬醛對黴菌的抗菌效力比對酵母菌強，此點也與山梨酸鉀相似。但是，苯甲酸鈉和山梨酸鉀都是酸性防腐劑，在基質pH4.5以下時抗菌效力較強，隨著pH上升其抗菌效力減弱，當基質pH5.5以上時，苯甲酸鈉幾乎無抗菌作用，山梨酸鉀在基質pH6.0以上時，抗菌效力也相當弱。而檸檬醛對黴菌的抗菌效力受基質pH影響較小，其抗菌活性pH範圍較廣，在3.5～7.5之間。表1檸檬醛等三種試劑的MIC值（單位：％）

注：培養基pH4.5。

2.2檸檬醛對酵母細胞生長曲線的影響
 　從圖1可以看出，空白對照魯氏酵母的調整期是9h，而含有檸檬醛的培養基酵母菌的調整期是22h，明顯延長，超過空白樣的1倍以上；空白對照樣的對數生長期是21h，而試驗樣的對數生長期是8h，縮短了1.6倍；空白對照樣的穩定期大約是30h，而試驗樣的穩定期隻有17h，縮短了43％。再從對數生長期末細胞總數測定點看，空白對照樣的C點OD值是0.49，而對照樣的C’點OD值僅0.24，其細胞總數僅相當於空白對照樣的49％。　另外，從對數生長期細胞大小測定看，試驗樣平均細胞大小比空白對照樣小18％左右，試驗樣的細胞發育受到影響。　由此可見，檸檬醛對易引起多種食品腐敗變質的魯氏酵母生長繁殖的影響是顯著的：生長適應的調整期延長，對數生長期和穩定期縮短，細胞總數減少了55％，細胞個體平均較對照組為小。酵母菌與黴菌同屬於真菌，有一些共同之處，可以推測，檸檬醛對黴菌生長繁殖的抑製也可能有類似情況。2.3檸檬醛對黃曲黴產毒的影響表2檸檬醛對黃曲黴產毒的影響

注：菌絲生長情況：“—”表示肉眼看不到菌絲，無黴斑；“＋”表示能看到稀少的菌絲或發芽孢子，無黴斑；“＋＋”表示能看到較多的菌絲或出現黴斑；“＋＋＋”則指試樣表麵幾乎全部被菌絲及孢子覆蓋或出現黴斑。　熒光強弱：“○”為無熒光；“＋，＋＋，＋＋＋”為強度依次遞增。黃曲黴毒素B1值為2次平行試驗平均值。　從表2可見，添加0.10％、0.05％檸檬醛的花生察氏培養基接種產毒黃曲黴培養6d，其菌絲生長情況與對照組相近，而熒光反應卻較對照組為弱，說明檸檬醛有抑製黃曲黴產毒的作用,其中添加了0.10％檸檬醛的試驗皿具有代表性(菌絲生長與對照組相近，而熒光反應卻較添加0.05％檸檬醛的更弱，說明產毒受到的抑製更強)。　選取添加0.10％檸檬醛的花生察氏培養基的樣本及對照組樣本，分別用矽膠薄層層析法測定AFTB1。重複一次，取平均值。添加0.10％檸檬醛的花生察氏培養基其AFTB1為1.14mg/kg(檢測兩次數據分別為1.20mg/kg、1.08mg/kg)，對照組樣品AFTB1為6.08mg/kg(5.98mg/kg、6.18mg/kg)。在有利於黃曲黴生長的花生察氏培養基中添加了促進黃曲黴毒素產生的微量元素Zn，在這樣的培養基中，由於添加了0.10％檸檬醛使AFTB1的產生減少了81％，可見檸檬醛抑製黃曲黴產毒的效果是顯著的。

3結語　天然檸檬醛是山蒼子油的最大組分，對多種真菌的抗菌效力與公認較好的合成食用防腐劑山梨酸鉀相近，明顯優於苯甲酸鈉，而且檸檬醛的抗菌活性pH範圍較寬廣，不僅對酸性食品有效，對中性食品也有效。而且檸檬醛能顯著抑製魯氏酵母的生長繁殖，對多種酵母也有抗菌效力。同時，檸檬醛對黃曲黴產生黃曲黴毒素有較強的抑製作用，可以使毒素的產生減少81％。檸檬醛具有濃鬱的檸檬果香味，不僅是很好的食品增香劑，而且還可以作為食品特別是易汙染黴菌及黃曲黴毒素的花生、玉米類食品如花生蛋白飲料、花生糖果、花生醬以及玉米快餐食品等的良好防腐保鮮劑。

作者：餘伯良  羅惠波  周健  張佳寧  

作者單位：四川輕化工學院 四川輕化工學院 四川輕化工學院 四川輕化工學院

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