短小芽孢杆菌作試驗菌測定四環素類抗生素效價

摘要　采用管碟法，測定短小芽孢杆菌對四環素類抗生素的敏感度，並與藤黃微球菌進行比較。結果概率分析表明，兩種試驗菌測定的效價無顯著差異，表明短小芽孢杆菌法優於中國藥典1995年版方法。
　　四環素類抗生素(土黴素、金黴素、四環素等)微生物檢定法采用的試驗菌種，各國藥典規定不一。英國藥典^〔1〕采用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，美國藥典^〔2〕采用金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，日本標準^〔3〕與中國藥典^〔4〕均采用藤黃微球菌(Micrococcus lutea)。鑒於以藤黃微球菌作試驗菌存在諸多缺點(菌種容易變異、培養時間長、抑菌圈邊緣欠清晰、測定結果誤差大)，而英美兩國藥典所收載的色譜法^〔1，2〕在我國目前又難於普及，本文試用短小芽孢杆菌作為四環素類抗生素效價測定的試驗菌種，並獲較滿意結果。
　　1　材料
　　1.1　藥品　四環素類抗生素(西安藥廠、光華藥廠及福州抗生素廠等，包括原料藥、片劑、軟膏)；四環素類抗生素標準品(中國藥品生物製品檢定所)。
　　1.2　實驗菌株　短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63202〕(按中國藥典1995版二部附錄72頁方法製成透光率為25%的菌液)；藤黃微球菌〔CMCC(B)28001〕(製成透光率為20%的菌液)。
　　1.3　培養基　Ⅰ號培養基pH 7.8～8.0，Ⅱ號培養基pH 6.6(中國藥品生物製品檢定所)。
　　1.4　磷酸鹽緩衝液　pH6.0緩衝液(KH₂PO₄ 8 g，K₂HPO₄ 2 g，加水至1L；pH8.0緩衝液(KH₂PO₄ 0.523 g，K₂HPO₄ 16.73 g，加水至1L)；pH 4.5緩衝液(KH₂PO₄ 13.6 g，加水至1L)。
　　2　方法
　　采用短小芽孢杆菌：一劑量法^〔5〕測定四環素與土黴素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8，中心濃度為8 u/ml，濃度範圍為4～20 u/ml。二劑量法^〔4〕高低劑量分別為8，4 u/ml。一劑量法測定金黴素效價的標準曲線劑間比例為1∶0.8，中心濃度為1 u/ml，濃度範圍為0.25～10 u/ml。二劑量法高低劑量分別為1，0.5 u/ml。
　　采用藤黃微球菌：標準曲線製備同中國藥典1977年版，二劑量法按中國藥典1995年版操作。
　　2　結果
　　2.1　抑菌圈　采用pH6.0磷酸鹽緩衝液及Ⅱ號培養基，短小芽孢杆菌的抑菌圈清晰度較好。按2%～3%比例將短小芽孢杆菌液加入培養基作為菌層，35℃～37℃的條件下培養14～16 h，所得到的抑菌圈大小較為合適(表1)。
表1　短小芽孢杆菌測定抑菌圈直徑(mm)

樣品	菌液加入量(%)	高劑量	低劑量
四環素	2	22	19
土黴素	2	21	18
金黴素	3	20	17

2.2      試驗菌測定的標準曲線　見表2。

 表2　兩種試驗菌標準曲線斜率

樣品	短小芽孢杆菌	藤黃微球菌
四環素	1.67	1.41
土黴素	1.13	1.18
金黴素	1.36	1.49

2.3      兩種試驗菌測定的效價　表3～5。　

表3　兩種試驗菌測定土黴素效價對比

樣品*	序號	短小芽孢菌	藤黃微球菌	差值
片劑(%)	1	72.3	73.9	－1.6
	2	93.6	93.1	0.5
	3	69.2	69.5	－0.3
	4	98.3	100.1	－1.8
	5	82.2	79.7	2.5
	6	95.4	93.1	2.3
	7	81.3	82.6	－1.3
	8	81.9	81.5	0.4
	9	92.0	91.0	1.0
	10	101.9	102.8	－0.9
原料(u/mg)	11	93.8	92.4	1.4
	12	878	878	0
	13	876	874	4
	14	876	875	1
	15	874	873	1
	16	865	875	－10
	17	859	875	－10

　　注：^*序號12～17樣品數據由西安光華製藥廠提供

表4　兩種試驗菌測定四環素效價對比

樣品*	序號	短小芽孢杆菌	藤黃微球菌	差值
片劑(%)	1	78.5	76.4	2.1
	2	97.1	91.7	5.4
	3	86.2	89.1	－2.9
	4	94.2	95.8	－1.6
	5	81.3	82.6	－1.3
	6	85.2	86.1	0.9
原料(u/mg)	7	999	978	21
	8	986	978	8
	9	986	976	10
	10	976	979	－3
	11	994	989	5
	12	988	979	9
	13	991	988	3
	14	983	979	4
	15	985	979	6
	16	986	980	6
	17	987	981	6
	18	976	970	6
粗製品(u/mg)	19	716	704	－12
	20	682	681	1

　　注：^*序號8～19樣品數據由西安製藥廠提供

表5　兩種試驗菌測定金黴素效價對比

樣品	序號	短小芽孢杆菌	藤黃微球菌	差值
原料(u/mg)	1	890.0	896.8	－6.0
	2	877.1	893.6	－16.5
	3	881.0	884.0	－3
	4	871.0	868.2	2.8
	5	888.6	873.4	15.2
	6	906.7	916.9	－10.2
軟膏(%)	7	103.8	103.8	0

2.4      雜質含量測定　結果見表6。

表6　兩種試驗菌測定四環素產品雜質含量結果(u/mg)

雜質名稱	短小芽孢杆菌	藤黃微球菌	差值
4-差向四環素	394.8	372.0	22.8
脫水差向四環素	5.9	6.0	－0.1
脫水四環素	17.6	7.6	10.0

　　 4　討論與小結　　①表2顯示，兩種試驗菌測定結果無顯著差異，曲線斜率均較穩定，兩條直線互相平行。②表3～表5列出四環素(20批)、土黴素(17批)及金黴素(7批)的考核數據。概率分析表明，兩種試驗菌測定的效價無顯著差異(P＞0.05)。③四環素類抗生素不夠穩定，尤其是四環素與金黴素的差向化均較快，產品中差向金黴素含量可高達16%～17%。表6顯示，兩種試驗菌對各種雜質的敏感度無明顯差異(表中脫水四環素之測定含量兩項數據，有待進一步予以驗證)。④四環類抗生素微生物檢定法改用短小芽孢杆菌測定的優點在於：菌液穩定，可保存較長時間，供隨時取用，無需臨時製備；菌種靈敏；抑菌圈成形快(培養時間短於15 h)；抑菌圈清晰，邊緣整齊，便於準確測量，故而誤差小，複試率低；菌液耐溫，可在70℃左右的培養基上攤布菌層。

作者：傅燕芳  張正潔  張玉良  李曉珍

作者單位：西安市藥品檢驗所!西安710054 西安製藥廠 西安製藥廠 西安市藥品檢驗所!西安710054
　　參考文獻
　　1　BP 1993：150，472，661；A166
　　2　USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
　　3　日本抗生物質醫藥品基準解說1990：333
　　4　中國藥典1995年版二部.1995：附錄70～74
　　5　中國藥典1977年版二部.1997：附錄

 

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