致瀉性大腸杆菌中發現小腸結腸炎耶爾森菌毒力島

【 摘要 】　目的　研究腸產誌賀樣毒素且具侵襲力的大腸杆菌(ESIEC)菌株是否含有耶爾森菌的HPI(毒力島)基因。 方法　采用PCR擴增和Southern雜交的方法。結果　從35%的ESIEC菌的染色體上同時擴出irp1、irp2和fyuA 3個片段，片段大小分別與小腸結腸炎耶爾森菌WA菌株的相應片段一致，鼠疫耶爾森菌HPI上的6對引物均未擴出目的片段。65%的ESIEC使用以上9對引物未擴出目的片段。ESIEC菌的染色體EcoRI酶切產物電泳後與小腸結腸炎耶爾森菌WA菌株的fyuA探針雜交出大小一致的條帶，與irp1和irp2探針雜交出不同的帶型。 結論　ESIEC菌含有小腸結腸炎耶爾森菌的HPI，且有變異現象。ESIEC和EAEC的關係還有待於進一步的研究。

　　【 Abstract 】　Objective　To study whether the genes of HPI island of Yersinia is existed in enteric Shigelloid-toxin producing and invasive Escherichia coli (ESIEC). Methods　PCR amplification and Southern blots. Results　The PCR results showed that 35% ESIEC strains (n=43) yielded irp1, irp2 and fyuA fragments, of which the molecular size were identical to those of Yersinia enterocolitica WA. All of the E.coli strains tested were negative for other genes of HPI island which were existed in Y. pestis but not in Y.enterocolitica. The two E.coli strains with irp1, irp2 and fyuA gene were selected for further study. The chromosomal DNA was digested by EcoR Ⅰand hybridized with irp1, irp2 and fyuA DNA probes respectively, which were synthesized by PCR with chromosomal DNA of Y. enterocolitica as template. When fyuA probe was used, the Southern hybridization patterns of the two E. coli strains were identical to that of Y. enterocolitica WA. When irp1 and irp2 probe were used, the molecular size of hybridized fragments were different from that of Y. enterocolitica WA. Conclusion　The HPI island of Y. enterocolitica was found to exist in 35% of ESIEC strains tested, and variation in restriction sites of various genes was observed.

　　【 Subject words 】　Diarrheagenic Escherichia coli; Yersinia spp; Pathogenicity island

　　根據毒力因子、致病機理、臨床特征等研究進展，目前國際上把致瀉性大腸杆菌分為五類：產毒性大腸杆菌(enterotoxigenic E.coli, ETEC )、致病性大腸杆菌（enteropathogenic E.coli, EPEC）、出血性大腸杆菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)、集聚性粘附大腸杆菌(Enteroaggregative E.coli, EAggEC)和侵襲性大腸杆菌(Enteroinvasive, E.coli, EIEC)^〔1〕。徐建國等人從我國分離並命名了一類新的致瀉性大腸杆菌，即產誌賀樣毒素且具侵襲力的大腸杆菌（Entero-shiga-like-toxin-producing and invasive E.coli, ESIEC）。這類菌能同時與Inv、SLT1或SLT2探針雜交呈陽性反應，對Hep-2細胞呈集聚性粘附，但不與EAggEC特異性探針反應，且不具有EIEC及誌賀氏菌的ipaB基因^〔2〕。

　　近年來，在醫學細菌學領域出現了一個新名詞——毒力島（pathogenicity island）。毒力島的發現和研究對了解細菌致病性和毒力因子具有重要的意義。許多病原性細菌中都存在著毒力島，毒力島和新的病原菌的產生有著密切的關係^〔3,4〕。目前已在泌尿道致病性大腸杆菌、沙門菌、誌賀杆菌、耶爾森菌、幽門螺杆菌、霍亂弧菌等細菌中發現毒力島的存在^〔3-5〕。耶爾森菌中的毒力島稱之為HPI(High-pathogenicity island)^〔6〕，它是對小鼠致病性所必需的^〔7〕。Schubert等^〔6〕1998年報道在許多粘附性大腸杆菌存在小腸結腸炎耶爾森菌的HPI基因，在一部分ETEC、EIEC、EPEC、EHEC中也存在著HPI。鑒於我們命名的ESIEC菌株具有明顯的粘附特性，本研究的目的就是研究ESIEC菌株中是否含有HPI基因。

表1　本研究工作中所用的引物

　　Table 1. Primers used in this work

　　材料與方法

　　菌株：小腸結腸炎耶爾森菌WA株（O8型）由衛生部醫學分子細菌學重點實驗室景懷奇副研究員提供。43株ESIEC為1988～1990年從北京地區腹瀉病患者糞便標本中分離，使用DNA探針進行了檢測，被命名為ESIEC的菌株^〔2〕。

　　染色體的製備：提取染色體按Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega公司生產)方法。

　　PCR擴增：以細菌的染色體DNA為模板。所用引物由Sangon公司合成，Taq酶為Sangon公司產品。引物序列見表1。irp1、irp2和fyuA基因為鼠疫耶爾森菌和小腸結腸炎耶爾森菌的共有基因。其餘的基因為鼠疫耶爾森菌所特有。

　　Southern雜交：細菌染色體DNA用EcoRI酶切，0.7%瓊脂糖凝膠電泳後轉印到硝酸纖維素膜上^〔8〕。以小腸結腸炎耶爾森菌染色體DNA為模板，用y7/y8、1-1/1-2和2-上/2-下引物對分別擴增出irp1、irp2和fyuA片段，用DIG DNA Labeling and Detection Kit(Boehring Mannheim,Germany)對這些片段進行標記，分別得到探針irp1、irp2和fyuA。將這些探針在沸水中熱變性後分別與硝酸纖維素膜進行雜交。68℃預雜交2h，雜交16h。顯色檢測按上述Kit說明書進行。

　　結果

　　1.PCR擴增：以各個菌株的染色體DNA為模板進行PCR擴增，43株ESIEC中的15株（35%）能夠同時擴出irp1、irp2和fyuA片段，其相對分子質量(M_r)與小腸結腸炎耶爾森菌的相應PCR片段一致（圖1）。根據鼠疫耶爾森菌HPI所特有的、小腸結腸炎耶爾森菌所沒有的另外的6個基因所設計的引物進行PCR實驗，均未在ESIEC菌株中擴增出目的片段。

　　2.Southern印跡雜交：將2株PCR實驗證明含有HPI基因的ESIEC菌株和一株PCR實驗證明沒有HPI基因的ESIEC菌株，提取染色體DNA，用EcoRⅠ酶切，分別用irp1、irp2和fyuA基因的DNA探針進行Southern雜交。結果顯示，HPI陽性的ESIEC菌株有1條帶與irp1探針雜交，而小腸結腸炎耶爾森菌O8 WA菌株有2條帶雜交（圖2A）。但是，小腸結腸炎耶爾森菌WA菌株的兩條雜交帶的M_r之和與ESIEC的雜交條帶的M_r一致。因此，可推測小腸結腸炎耶爾森菌O8 WA菌株的含有irp1基因的DNA片段比ESIEC的多出一個EcoRⅠ位點(圖3)。

　　小腸結腸炎耶爾森菌O8 WA菌株與irp2探針的雜交條帶的分子量比ESIEC菌的雜交條帶略小（圖2B）。可能是由於WA菌株染色體含有irp2基因的DNA片段的近端存在EcoRⅠ位點，或者是由於EcoRⅠ切點在irp2探針對應ESIEC染色體位置的遠端(圖3)。

 　　討論

　　Schubert等^〔6〕1998年報道，在92%的粘附性大腸杆菌、20%的EIEC、5%的EPEC和ETEC、82%的從血液標本分離的大腸杆菌中發現小腸結腸炎耶爾森菌HPI毒力島基因的存在。鑒於HPI在致瀉性大腸杆菌中的廣泛存在，本研究的目的就是要了解HPI在ESIEC菌株中存在的情況。使用PCR實驗發現，35%的ESIEC菌株含有小腸結腸炎耶爾森菌的irp1、irp2和fyuA基因（圖1）。進而對2株PCR實驗證明含有HPI的菌株和1株不含HPI的ESIEC菌株進行了Southern雜交分析。結果顯示，ESIEC中的irp1和irp2基因與小腸結腸炎耶爾森菌略有不同（圖2A，2B）。ESIEC菌株和irp1探針雜交的片段比小腸結腸炎耶爾森菌多出一個EcoRⅠ位點。fyuA基因在ESIEC中相對比較保守，雜交帶型與小腸結腸炎耶爾森菌一致（圖2C）。研究表明，在ESIEC菌株中存在著HPI，並且部分毒力島基因在酶切位點不同，有變異現象。結果提示，ESIEC菌株的HPI可能和耶爾森菌毒力島不完全相同，值得進一步深入的研究。

　　我們已經使用DNA探針等技術證明ESIEC和ETEC、EPEC、EHEC、EIEC、EAggEC不同。既然ESIEC和粘附性大腸杆菌都含有HPI，那麽二者之間的關係如何粘附性大腸杆菌是很早就命名的一類致瀉性大腸杆菌，ESIEC是新近才命名的，是從我國腹瀉病患者的糞便標本分離、使用常規方法不能夠鑒定的、和誌賀樣毒素探針雜交的一類大腸杆菌。粘附性大腸杆菌的概念並不明確，除了對上皮細胞的粘附外，到目前為止還沒有特異性的鑒定指標。Schubert等使用的粘附性大腸杆菌菌株經細胞粘附實驗證明對上皮細胞具有集聚性粘附現象，但是沒有進行DNA探針實驗， 不清楚是否屬於EAggEC。我們的ESIEC對Hep-2細胞也呈集聚性粘附，但不與EAggEC特異性探針反應，不屬於EAggEC。動物實驗結果提示，ESIEC和EHEC的致病特點相似^〔13,14〕。細胞凋亡實驗結果顯示，ESIEC和ETEC、EIEC、EPEC、EHEC、EAggEC明顯不同，是一類獨特的致瀉性大腸杆菌^〔15〕。關於ESIEC菌株中的HPI致病作用以及攜帶HPI的ESIEC菌株和EAggEC的關係，還有待於進一步的研究。

　　HPI毒力島和LEE毒力島的發現，給致瀉性大腸杆菌的分類和研究帶來了一線生機。致瀉性大腸杆菌的分類比較複雜，存在著許多的問題。譬如，EPEC、EHEC都含有LEE毒力島。粘附性大腸杆菌含有HPI毒力島。隨著毒力島研究的不斷深入，很可能致瀉性大腸杆菌的分類會發生重大的變化。

　作者：伍建宏 葉長芸 徐建國

　基金項目：國家自然科學基金傑出青年基金資助項目

參考文獻

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