摘要： 目的 檢測臨床分離豬源致病性沙門菌四環素的耐藥基因，確定沙門菌四環素耐藥基因類型。方法 用KB法測定分離株對四環素等21種抗生素的耐藥情況，用PCR方法檢測四環素耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG及tetK，並對擴增產物進行測序。結果 臨床分離株全部對四環素耐藥，33株沙門菌中有29株擴增出tetB特異性片段，基因序列與參考菌的同源性為99%，tetB檢測與藥敏試驗陽性符合率為879%。結論 tetB的PCR檢測對四環素耐藥性具有較高的特異性，tetB基因是決定本試驗中臨床分離株四環素耐藥的主要基因，為四環素耐藥性的分子流行病學監測提供了依據。
關鍵詞： 沙門菌； 四環素耐藥基因； tetB； PCR； 豬
PCR amplification of tetB gene for pathogenic Salmonella isolated from diseased pigs
ABSTRACT Objective To detect the tetracycline resistance genes for 33 Salmonella isolates from diseased pigs and define the tetracycline resistance determinants. Methods The resistance of Salmonella isolates were detected by drug susceptibility tests with KirbyBauer (KB) diffusion method. PCR was designed to detect tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG and tetK. The amplified products were sequenced and alignment analysis was performed. Results The detection of tetracyclineresistance of 33 Salmonella isolates showed the resistance rate was 100%, but only the tetB was amplified from 29 of 33 isolates. The gene fragment shared 99% homology in nucleotides with the reference sequence. The result of PCR amplification was 879% identical with that of the drug resistance test. Conclusion The tetB was the main determinant responsible for tetracycline resistance in this study and PCR detection of tetB is a specific and reliable method for molecular epidemiology of tetracycline resistance in Salmonella.
KEY WORDS Salmonella; Tetracyclineresistance genes; tetB; PCR; Pigs
自20世紀40年代抗生素問世以來，它在各種常見細菌性疾病的治療中發揮了不可磨滅的作用。但隨著獸用抗生素在養殖業的廣泛應用，它的不良影響和對人類的傷害逐步顯現出來［1］。在人和動物的腸道內存在著許多相互製約、處於平衡狀態的正常菌群，長期過度使用抗生素導致菌群失調，產生耐藥菌群，即便已經停止使用相應抗生素，這些耐藥菌仍然繼續傳播耐藥性。同時致病菌的耐藥性可導致原本有效的抗生素臨床治療失敗［2］。四環素作為一種廉價的廣譜抗生素，幾乎占領了三分之二的獸藥領域。隨著它的廣泛應用，其耐藥性便成為首當其衝的問題［3］。沙門菌是一種重要的腸道病原菌，分布廣，危害大，動物沙門菌是世界各地人類食物中毒的主要致病菌［4］，因此，動物沙門菌的多重耐藥性對動物與人類健康造成嚴重威脅。檢測四環素耐藥基因(tet)是監測四環素耐藥性的重要手段。細菌的四環素耐藥基因有數十種之多，隨著細菌與宿主種類、地理環境不同而呈現多樣性分布［5～8］。代敏等報道從某些規模化豬場分離的豬源致病性沙門菌的四環素耐藥基因以tetC為主［9］。本實驗室臨床分離了數十株致病性豬源沙門菌，主要來自於湖北地區(18株)，涉及七個省市。其四環素耐藥基因是否與上述報道呈現差異尚不清楚。本文用PCR技術對四環素耐藥基因進行檢測，以期發現四環素耐藥基因的分子流行病學規律，為有效控製沙門菌感染提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 菌株與質粒豬源沙門菌分離株33株，為本實驗室從臨床疑似沙門菌病的病豬中分離，經培養特性和生化特性鑒定及血清型定型確定為不同血清型沙門菌，其中豬霍亂沙門菌21株、鼠傷寒沙門菌8株、豬傷寒沙門菌2株、劍橋沙門菌1株及山夫登堡沙門菌1株。藥敏試驗質控菌大腸埃希菌(ATCC25922)及金黃色葡萄球菌(ATCC25923)購自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸埃希菌ER2738［F′ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf∶∶Tn 10(TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lacproAB)Δ(hsdMSmcrB)5 (rk- m k- McrBC-)］為四環素耐藥基因tetB的陽性參考菌。質粒pBR322 (GenBank登錄號J01749)為tetC的陽性對照。
1.2 主要試劑MH瓊脂、抗生素藥敏紙片與SS瓊脂等購自杭州天和微生物試劑有限公司，LB培養液、TaqE、dNTP等購自大連寶生物有限公司。
1.3 方法(1)藥敏試驗 藥敏實驗采用KirbyBauer(KB)紙片擴散法［10］。以大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質控菌，依據美國實驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS)2003年頒布的判定標準區分耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)等三種藥物感受狀態。所用抗生素包括①氨基糖苷類：阿米卡星(AMK)，慶大黴素(GM)，卡那黴素(KM)，新黴素(NM)，鏈黴素(SM)；②氟喹諾酮類：環丙沙星(CPLX)，恩氟沙星(ENLX)，諾氟沙星(NFLX)；③β內酰胺酶類：氨苄西林(ABPC)，阿莫西林(AMPC)；④其它：紅黴素(EM)，氯黴素(CP)，多西環素(DOXY)，多黏菌素B(PLMB)，利福平(RFP)，四環素(TC)，複方磺胺甲口惡唑(TMP/SMZ)等17種抗菌藥。(2)四環素耐藥基因的擴增及檢測根據GenBank中的基因序列，並參照文獻［11］報道的序列設計引物tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetK和tetG(表1)，由北京奧科生物工程公司合成。細菌在含四環素(25μg/ml)的LB液體培養基中，
表1 擴增四環素耐藥基因所用引物序列（略）
F：為上遊引物；R：為下遊引物。
2 結果與分析
2.1 藥敏實驗測定藥敏紙片產生的抑菌環直徑，依據CLSI/NCCLS頒布的判定標準，記錄沙門菌對各種抗生素的耐藥性。結果表明，33株沙門菌均表現出多重耐藥性，對四環素的耐藥率為100%(表2)。
2.2 耐藥基因的擴增用設計的7對引物對33株沙門菌進行四環素耐藥基因擴增，結果從29株細菌中擴增出tetB產物，大約700bp，與欲擴增的目的片段預測大小一致(圖1、圖2)。藥敏試驗與tetB基因檢測的陽性符合率為879%(29/33)。4株tetB陰性的沙門菌血清型分別為：劍橋沙門菌、山夫登堡沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌。進一步對tetB擴增片段進行測序鑒定，結果顯示，參考菌大腸埃希菌ER2738的四環素耐藥基因與分離株的tetB的同源性為99%，與GenBank中的發表序列(登錄號：AF326777，AJ278685，AB089595)的同源性為99%，說明擴增到的片段為tetB基因片段，且tetB為一較保守的基因。以質粒pBR322(GenBank登錄號J01749)為陽性對照， 對tetC進行PCR擴增。 雖然本研究從pBR322中成功擴增出tetC基因的特異性片段，但所有沙門菌分離株均未擴增出tetC特異條帶。用梯度PCR對tetA、tetD、tetE、tetG、tetK基因進行擴增，均未獲得特異性產物。
表2 豬源致病性沙門菌的多重耐藥性（略）
圖1 22株沙門菌tetB的PCR擴增結果（略）
圖2 7株沙門菌tetB的PCR擴增結果（略）
3 討論
對臨床分離的33株豬致病性沙門菌進行藥敏分析，發現所有菌株均有多重耐藥性，表明豬源沙門菌的耐藥性相當嚴重。因為這些分離株均來自臨床疑似沙門病的發病豬，臨床治療固然在這些沙門菌的耐藥性產生中起重要作用，但飼料抗生素添加劑的作用也不容忽視。沙門菌是導致人類食物中毒的主要細菌，在許多國家均位於食物中毒病原微生物之首［12，13］，加之豬肉在我國肉類總產量中占有約2/3的比例，所以豬源致病性沙門菌的嚴重多重耐藥性應引起高度重視。四環素類為廣譜抗生素，通過結合在核糖體上，阻止氨基酰tRNA(aminoacyltRNA)與核糖體位置A結合，從而抑製蛋白質的合成，在醫學與獸醫學上廣泛用於治療革蘭陰性菌、陽性菌感染及衣原體、支原體、立克次體與某些原蟲感染［14］。本研究中所檢測的沙門菌分離株100%對四環素具有耐藥性，可能與四環素的廣譜特性及大量使用有關。細菌產生四環素耐藥性的機製有多種，包括核糖體保護機製、藥物排出泵機製、酶鈍化機製等，由不同的四環素耐藥基因(tet)決定［9，14，15］。目前已經鑒定了29種四環素耐藥基因及三種氧四環素(或土黴素)耐藥基因(otr)［14］。藥物導出泵機製是將進入細胞內的四環素由導出泵排出細胞外，細菌表現出耐藥性。與藥物排出泵機製相關的耐藥基因包括：tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetI、tetJ、tetZ、tet30、tet31、tetK、tetL、otrB、tcr3、tetPA、tetV和tetY等［14］。核糖體保護機製通過耐藥基因編碼的核糖體保護蛋白(ribosomal protection protein，RPP)發揮作用。核糖體保護蛋白將四環素從核糖體上釋放出來，氨基酰tRNA可以與核糖體A位置結合，蛋白質翻譯得以正常進行［15］。與核糖體保護機製相關的耐藥基因有：tetM、tetO、tetS、tetW、tetQ、tetT、otrA、tetPB等［14］。與酶鈍化機製有關的耐藥基因有tetX。tetX編碼蛋白為一種氧化還原酶，通過化學修飾四環素使四環素失去活性［14，16］。四環素耐藥基因的分布存在多樣性，不同細菌、宿主種類及地理位置等都表現出四環素耐藥基因的差異［6］。一般認為，革蘭陰性細菌的耐藥機製以抗生素的導出泵機製為主［17］，對豬體內細菌及腸道菌而言，其決定導出泵的耐藥性基因以tetB為主［18，19］。本研究對豬源致病性沙門菌分離株的檢測結果與上述報道一致，33株細菌中有29株檢出tetB基因，測序鑒定其序列與參考序列的同源性99%。tetB檢測與藥敏實驗的陽性符合率很高，達879%，說明tetB是決定沙門菌臨床分離株四環素耐藥性的主要基因。對耐藥沙門菌進行SDS質粒消除試驗，可以使耐藥性消失，說明該四環素耐藥基因tetB存在於質粒上(資料未顯示)。本研究未檢測出tetC基因，與代敏等報道tetC介導豬源致病性沙門菌的結論不一致［9］。由於本研究所用PCR能從陽性對照(pBR322)中成功擴增出tetC，說明樣本中tetC的陰性檢測結果是可靠的。至於與相關報道的差異，可能與沙門菌分離株的宿主及地域來源不同有關。本研究的33株沙門菌來自於包括湖北地區在內的七個省市，分別為：湖北(18株)，福建(4株)，河南(3株)，上海(3株)，浙江(3株)，山東(1株)，河北(1株)。除了tetB與tetC外，還對tetA、tetD、tetE、tetG和tetK等耐藥基因進行了擴增。為減少方法誤差，所有擴增均采用梯度PCR。但是，除了tetB以外，所研究的耐藥分離株中未檢測到其它耐藥基因。有些沙門菌經藥敏試驗證明具有耐藥表型，但未能檢測到耐藥基因，這可能因為其耐藥性由其它耐藥基因決定或存在其它耐藥機製。本試驗未發現含有耐藥基因但藥敏分析不表現耐藥性的現象，說明耐藥基因檢測是一種非常特異可靠的沙門菌四環素耐藥性監測方法。由於四環素存在數十種耐藥基因，且基因分布多樣化，為了完全弄清我國沙門菌四環素耐藥基因的分布現狀及規律，還需進行更廣泛的分子流行病學調查。
作者：劉維紅 徐引弟 郭愛珍 賈愛卿 劉軍發 陳煥春
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