【摘要】 目的：建立以16S rRNA為靶基因的PCR反向線點雜交技術（RLB）檢測淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, NG），並與塗片法及培養法比較。方法：選擇NG 16S rRNA基因設計一對PCR引物，生物素標記下遊引物擴增NG DNA，然後與固定在尼龍膜上的特異性寡核苷核探針雜交。並對115例性病高危人群標本進行檢測，然後與塗片法與培養法檢測結果進行比較。結果：PCR擴增NG DNA的片段長度分別為414 bp。通過對115例臨床標本的檢測， PCR/RLB的陽性率為31.3%,而塗片法和培養法的陽性率分別為15.7%和21.7%。 結論：PCR/RLB是一種快速、敏感的檢測方法，對NG感染的實驗診斷具有十分重要的意義。
【關鍵詞】 聚合酶鏈反應；核酸雜交；淋病奈瑟氏菌
The study of Comparing with Smear, Culture and PCRreverse Line Hybridization Assay for Detecting Neisseria Gonorrhoeae
Abstract：Objective To develop 16S rRNA PCRreverse line blot hybridization (RLB) assay for detection of N. gonorrhoeae and compare it with smear and culture methods. Methods The DNA from N. gonorrhoeae was amplified with the one set of primer for the 16S rRNA gene. The reverse primers were labeled with biotin. The products were identified by hybridization with its specific oligonucleotide probes labeled with amidogen in a nylon membrane. Then using PCRRLB to detect 115 specimens and compare it with smear and culture methods. Results The length of PCR products was 414 bp. The PCRRLB positive rate (31.3%) is higher than smear (15.7%) and culture (21.7%)(P<0.05). Conclusion The results of PCRRLB in detecting N. gonorrhoeae also provided excellent results. It plays the very important role in detecting of clinical pathogens.
Key words：Polymerase chain reaction; Nucleic acid hybridization; Neisseria gonorrhoeae
淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae ，NG）感染引起的一種常見的性傳播疾病（STD），約占全球STD病例的3/4，在我國亦呈逐步蔓延之勢［1］。流行病學資料顯示NG感染是加速HIV傳播的危險因素，所以選擇更加特異、敏感的檢測方法對於NG的準確診斷及HIV的防治都具有十分重要的意義［2］。近年來核酸擴增技術在NG感染檢測方麵得到了廣泛的應用,特別是PCR技術，相比於傳統的培養法，核酸擴增技術具有較高的敏感性和易於標本收集轉運。本文利用以16S rRNA基因作為靶基因設計PCR引物,再結合反向線點雜交技術對115份臨床標本進行檢測，並將結果與塗片法和培養法進行比較。
1 材料和方法
1.1 材料
115份性病高危人群標本來源於深圳市福永醫院門診患者，每人同時收集3份標本，1份做塗片，1份做培養，1份做PCR/RLB檢測。
Biobyne C 尼龍膜由Pall公司生產，鏈親和素過氧化物酶接合物由Roch 公司生產，Taq酶、dNTP購自MBI公司。 Eppendorf公司PCR擴增儀和Shellab雜交箱。
1.2 方法
標本塗片自然幹燥後，革蘭染色鏡檢，找到多核白細胞內革蘭陰性雙球菌者為陽性。
標本同時接種於血瓊脂平板和選擇性淋病奈瑟菌培養基，置5%~10%燭缸內，在
將標本置於含有100 μl PCR裂解液（含
反義引物5'端為生物素標記，特異性探針5'端用氨基標記（見表1）。PCR反應體係25 μl，含10 buffer 2.5 μl，42.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mol/L MgCl2 1.5 μl, 5U/μlTaq 酶0.2 μl，50 pmol引物各0.2 μl，模板5 μl，補水至25 μl。反應條件：
製備BiodyneC尼龍膜參見文獻［3］。用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀釋opap和SL80p探針，使探針濃度分別為1.25 pmol、0.625 pmol和0.313 pmol。
參見文獻［3］簡述之，將PCR擴增產物取5 μl加入含170 μl 2×SSPE/0.1%SDS溶液的管中，混勻後
2 結果
115份性病高危人群的臨床標本經PCR/RLB檢測其陽性率31.3%（36/115），而塗片法與培養法分別為15.7%（18/115）和21.7%（25/115）。其中11份培養法陰性標本經PCR/RLB檢測為陽性，18份塗片法陰性標本經PCR/RLB檢測為陽性。不同的標本類型對三種方法的檢測影響不盡相同，其中前列腺液、宮頸拭子、尿道拭子和白帶標本利用塗片法其陽性檢出率最低，而培養法次之，而生殖道分泌物標本利用三種方法其陽性檢出率差異無顯著性。表2 PCR／RLB與塗片法和培養法檢測淋病奈瑟氏菌的比較(略)
3 討論
本文選用了編碼NG大亞基核糖體的16S rRNA基因作為檢測靶基因設計引物和探針。通過對115份標本檢測表明PCR/RLB陽性率最高，為31.3%，明顯高於塗片法（15.7%）和培養法（21.7%），其中塗片法最低，隻有15.7%，主要是對宮頸拭子、白帶、前列腺液和尿道拭子標本陽性檢出率較低。相比之下， 3種方法檢測生殖道分泌物其陽性檢出例數則無明顯差別。主要原因可能是由於尿道拭子標本和前列腺液中NG含量要少於生殖道分泌物。女性淋菌性尿道炎和宮頸炎不典型，無特異性，診斷依靠病原體鑒定，陰道內有類似淋病奈瑟菌形態的雜菌，塗片難以鑒別，而培養時，敏感性也不高。
由於PCR具有較高的敏感性，在DNA提取、PCR擴增、雜交過程是均需設立陽性和陰性對照，同時對RLB的雜交條件進行了優化。在本試驗中我們以氨基標記各特異性寡核苷酸探針5'端，再與尼龍膜上的羧基結合製備成膜芯片，並通過反向線點雜交使固定在尼龍膜上的探針與含有生物素標記反義引物的5'端的PCR產物雜交，然後通過化學發光檢測NG。與同位素標記探針結合放射性自顯影技術相比，該技術克服了放射性汙染，且具有檢測信號放大作用，具有較高的敏感度。與硝酸纖維膜作為載體相比較，尼龍膜除具有結合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力強，韌性較強，操作較方便外［4］。更重要的是可對重複用於雜交，一次雜交後，PCR產物可用1% SDS
本文著重對三種檢測NG的方法進行比較，相比之下PCR/RLB陽性率最高。它不僅可用於一般人群NG感染的初篩實驗，而且對於女性及慢性患者有較為理想的診斷價值，值得推廣應用。
作者：何大源，向華國，楊波，黃玉佳
【參考文獻】
［1］馮捷. 淋病的治療進展［J］. 中國全科醫學,2000,3(4):260262.
［2］向華國, 熊禮寬, 塗植光. 淋病奈瑟氏菌感染的實驗診斷進展［J］. 重慶醫學,2006,35(21): 19911997.
［3］Zwart G, van Hannea EJ, Kamstvan AM,et al. Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol,2003,69:58755883.
［4］盧聖棟.現代分子生物學實驗技術［M］.第2版.北京:中國協和醫科大學出版社，2004.
