蘇雲金芽孢杆菌與蠟狀芽孢杆菌親緣關係研究

【摘要】  目的 探討蘇雲金芽孢杆菌（Bt)與蠟狀芽孢杆菌（Bc）的親緣關係,為Bt鑒定、安全性評價及降低其致病風險等提供科學依據。方法 采用腸杆菌基因間重複一致序列-PCR（ERIC-PCR）技術，對6株蘇雲金芽孢杆菌和3株蠟狀芽孢杆菌及對照菌株的基因組DNA進行擴增，對其指紋圖譜進行分析；回收並克隆重複性好的蘇雲金芽孢杆菌基因組DNA擴增片段，以其為探針，分別與供試菌株基因組DNA進行雜交。結果 與蠟狀芽孢杆菌相比，蘇雲金芽孢杆菌菌株間基因組DNA指紋圖譜較一致；所有供試蘇雲金芽孢杆菌菌株均擴增產生一條250bp左右的片段；蘇雲金芽孢杆菌與蠟狀芽孢杆菌均可擴增產生600bp左右的共有DNA片段。此外，以蘇雲金芽孢杆菌500bp片段為探針與蘇雲金芽孢杆菌基因組DNA雜交有很好的特異性。結論 腸杆菌基因間重複一致序列-PCR指紋圖譜可以正確反映蘇雲金芽孢杆菌與蠟狀芽孢杆菌親緣關係；500bp片段可以作為蘇雲金芽孢杆菌鑒定探針。

【關鍵詞】  蘇雲金芽孢杆菌

　　蘇雲金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)與蠟狀芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同屬於蠟狀芽孢杆菌菌群，為自然界中廣泛分布的革蘭陽性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成對昆蟲有毒性的伴胞晶體。因此，被作為生物殺蟲劑廣泛應用於農業及衛生害蟲的生物防治；Bc則是人畜條件致病菌，可導致人食物中毒和感染，引起嘔吐和腹瀉〔2〕。研究表明，在自然環境中，兩者染色體體外遺傳物質可以出現高度重組〔3〕，在DNA水平也具有較高的同源性，隻有個別堿基有差異〔4〕。由於Bt與Bc的相似性，許多細菌分類學家認為Bt與Bc應為同一個種〔5〕。Bt和Bc間的同源性關係，使Bt安全性問題越來越受到人們重視。因此，為研究兩者的親緣關係，對Bt的鑒定、Bt應用的安全性評價，以及進一步提高Bt殺蟲效力、降低其致病風險，本文利用腸杆菌基因間重複一致序列（ERIC）－PCR技術〔6〕對Bt和Bc全基因組DNA進行擴增，對獲得的Bt和Bc基因組DNA指紋圖譜進行分析，探討Bt和Bc起源進化關係，同時篩選並克隆了Bt基因組DNA擴增片段，對應用ERIC-PCR技術鑒別、鑒定Bt和Bc進行可行性探討。結果報告如下。

　　1   材料與方法

　　1.1   材料

　　1.1.1   菌株   Bt 6株（菌株號為CGMCC 11749、CGMCC 11754、CGMCC 1294、CGMCC 1905、CGMCC 1989、CGMCC 11014），Bc標準株1株（菌株號為CGMCC 1126），大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黃色葡萄球菌等對照菌株各1株（菌株號分別為CGMCC 190、CGMCC 1933和CGMCC 189）〔購於中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC)〕，Bc分離株2株為沈陽出入境檢驗檢疫局分離,並經國標生化鑒定。

　　1.1.2   PCR引物及試劑   (1)ERIC引物: 由大連TaKaRa生物工程有限公司合成，引物序列分別為： PrimerⅠ：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，PrimerⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；（2）試劑：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal（大連TaKaRa生物工程有限公司）；pGEM－T vector連接轉化試劑盒（pGEM-T vectorSystem Ⅱ）及JM109高效率感受態細胞（美國Promega公司）；放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和隨機引物DNA標記試劑盒（Random Primer DNA Labeling System，英國Biolabs公司）；尼龍膜及3MM濾紙（英國Whatman公司）；其他試劑為本實驗室自配，均為分析純。

　　1.2   方法

　　1.2.1   菌株培養及其基因組DNA的提取   斜麵活化的菌株在LB 培養基中30℃搖床培養過液(200r/min) ,離心收集2ml 培養的菌體(4000r/min ,10min ,20℃) ,采用實驗室常規酚/氯仿法提取各菌株基因組DNA。所提取DNA經Beckman DU～640檢測，吸光度A260/A280值在18～19之間，純度符合PCR擴增條件。　　
　　1.2.2   ERIC-PCR反應條件及結果鑒定   (1)反應體係組成和反應條件:依據文獻方法〔7〕。PCR產物進行15％瓊脂糖凝膠電泳（U＝3V/cm；T＝100min）。DNA標準分子量為DL2000，PCR產物經溴化乙錠(EB)染色後在凝膠成像係統上照相。

　　1.2.3   PCR產物回收與克隆   將上述擴增產物利用15%瓊脂糖凝膠電泳分離。選取重複性好的Bt基因組DNA擴增片段，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收、純化。純化產物連於pGEM-T載體，轉入JM109感受態大腸埃希菌。連接反應、轉化操作以及克隆子的鑒定按照常規方法進行；陽性克隆子用NaOH/SDS堿裂解法製備質粒DNA。

　　1.2.4   斑點雜交   按照隨機引物DNA標記試劑盒（Random Primer DNA Labeling System）說明標記回收產物，以標記產物為探針，分別與供試菌株基因組DNA進行雜交。

　　1.2.5   引物設計及PCR驗證   發生特異性雜交反應的克隆片段由大連TaKaRa生物工程有限公司進行測序。利用Primer Premier 50軟件〔8〕,根據特異克隆片段序列信息設計引物，序列分別為:BthⅠ：5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物對應的擴增產物長度為363bp；PCR反應條件：94℃預變性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循環；72℃延伸5min。體係同ERICPCR。以6株Bt及其他對照菌株的染色體DNA作為模板，進行PCR反應。

　　2   結果

　　2.1   ERIC-PCR圖譜（圖1）   6株蘇雲金芽孢杆菌和3株臘狀芽孢杆菌的基因組DNA經ERIC-PCR擴增，均可產生清晰的DNA指紋圖譜，擴增片段範圍100～2500bp，各菌株擴增圖譜的多態性程度不同。Bt基因組DNA指紋圖譜較一致，由3條主帶構成，所有供試Bt菌株均有1條250bp左右的擴增片段，而蠟狀芽孢杆菌間DNA指紋圖譜變異較大。另外，Bt和Bc均可擴增得到600bp左右的共有片段。     
　　1：CGMCC 11749； 2：CGMCC 11754； 3：CGMCC 1294　4：CGMCC 1905； 5：CGMCC 1989； 6：CGMCC 11846　7：CGMCC 1126； 8,9：Bc分離株 B：negative control-no DNA　M：DL2000

　　圖1   Bt、Bc基因組DNA ERIC－PCR結果指紋圖譜（略）

　　2.2   斑點雜交（圖2）   純化、克隆指紋圖譜中穩定出現的Bt DNA擴增片段，經DU-640測定濃度約為90μg/L，以其為探針對固定於膜上的供試菌株基因組DNA進行斑點雜交。結果顯示，以500bp片段為探針，與蘇雲金芽孢杆菌雜交結果為陽性，枯草芽孢杆菌及屬外的各菌株雜交結果為陰性。

2.3   PCR驗證（圖3）   根據特異克隆片段序列設計的BthⅠ和BthⅡ引物對，可以從Bt菌的基因組DNA中擴增出約360bp的片段，符合預期結果；而所有對照菌株均沒有擴增條帶，表明此特異片段來源於Bt菌基因組DNA。1～6：Bt菌株；7,8,9：Bc 菌株；10：枯草芽孢杆菌；11：大腸埃希菌；12：金黃色葡萄球菌

　　圖2   500bp探針對各菌株雜交放射性自顯影15d照片（略）

　　1～6：Bt菌株；7,8：Bc菌株； 9：大腸埃希菌

　　圖3   引物BthⅠ和BthⅡ對Bt菌及對照菌DNA的擴增結果（略）

　　3   討論

根據本研究得到的Bt指紋圖譜的保守性和Bc指紋圖譜的變異性可以推測出，Bt在進化過程中出現較晚，這與Carlson等的Bt可能是獲得攜有cry基因質粒的Bc變種的觀點相符〔9〕。從本實驗的擴增圖譜中還可看出,Bt亞種tolworthi HD125與其他Bt菌株的主帶型一致，這一結果與Carlson 和 Kolsto關於腸毒素基因陰性Bt菌株起源的觀點一致，即Bc獲得cry基因後，進化為腸毒素基因陽性Bt菌株，然後失去該基因進化為腸毒素基因陰性Bt菌株〔10〕。另外，Bt與Bc均可擴增產生600bp左右的共有DNA片段，體現了二者在遺傳上的高度同源性。因此，ERIC指紋圖譜可以正確反映出Bt與Bc的親緣關係。由於Bt和Bc間的同源性關係，Bt安全性問題越來越受到人們重視〔11，12〕。本研究篩選到的500bp片段可作為蘇雲金芽孢杆菌的鑒定用探針。 

作者：宋樹森，金莉莉，王芳

【參考文獻】
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