青錢柳不同外植體組織培養及褐變防止的研究

【摘要】  　　目的探索青錢柳快速繁殖途徑和褐變的防止方法。方法分別在不同季節采取青錢柳的嫩芽、帶節莖段和嫩葉作為外植體，對外植體進行4種不同方式的處理後，接種到不同激素種類和激素組合的培養基中進行培養。結果春季取材更易誘導出愈傷組織和新芽；誘導莖段出芽的最佳培養基為B5+BA3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L +IBA0.01 mg/L；適宜於嫩葉、嫩芽愈傷組織誘導的培養基分別為：B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L和B5+2，4－D1.0mg/L+BA0.1mg/L；外植體先於4℃低溫預處理5 d和直接用燒紅的手術刀快速切割外植體後再進行接種可有效減少外植體的褐變。結論青錢柳組織培養可誘導芽的產生和愈傷組織的形成。

【關鍵詞】  青錢柳 組織培養 褐變

　　Abstract：ObjectiveTo study the rapid propagation and prevention of browning of Cyclocarya paliurus(Batal.)Ijinskaja. MethodsTender buds, nodular stem segments, and tender leaves were taken as explants in different seasons .The explants were treated in four different ways, and then cultured on different mediums.ResultsSpring was the best season for collecting and the most suitable medium for nodular stem segments to induce buds was B5+BA3.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L;as for tender leaves , B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L was optimum to induce callus, and B5+BA1.0 mg/L +NAA0.01 mg/L +IBA0.1 mg/L was the best for tender buds to form callus. Putting the explants under the condition of  4℃ for 5 days and cutting the explants quickly with a aglow scalpel before inoculating could decrease the browning effectively. ConclusionThe tissue culture of Cyclocarya paliurus (Batal.) Ijinskajacan can induce buds and callus .

　　Key words：Cyclocarya paliurus(Batal.) Ijinskaja；  In vitro culture；  Browning
   
　　青錢柳Cyclocarya paliurus(Batal.)Ijinskaja，係雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬植物［1］，又名青前李（江西）、山麻柳（四川）、甜茶樹（貴州）、一串錢（湖北）等，是我國獨有的單種植物，也是國家重點保護的瀕危植物之一。據《中國中藥資源誌要》記載，其樹皮、樹葉具有清熱解毒、止痛功能，可用於治療頑癬。相關研究報道，青錢柳不僅含有人體必需的鉀、鈣、磷、鎂等常量元素，還含有對人體具有保健作用的微量元素，被有關專家認為是可能治愈2型糖尿病的極佳良藥［2］。
   
　　青錢柳種子具有深休眠習性，自然生長的青錢柳不僅數量少，且多零星分布於深山老林，自然更生率低，人工栽培青錢柳的成活率也不高［3］，嚴重影響了青錢柳的開發利用與產業化進程。因此，對青錢柳進行快速繁殖成為目前迫切需要解決的問題［4］。目前，有關青錢柳組織培養的報道並不多，且培養過程中也沒有提及出現褐變現象［5,6］。本研究對不同外植體類型、不同季節取材、不同激素種類和激素組合等因素與青錢柳的組織培養的關係進行研究，探討不同處理方式與青錢柳組織培養褐變的關係，以期尋找到青錢柳組織培養中芽及愈傷組織誘導的最佳方法，為青錢柳快速繁殖提供技術支持和參考依據。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料以7年生青錢柳植株當年抽生枝條作為材料，取材季節分為春、夏、秋季三季采摘。

　　1.2  方法 

　　1.2.1  外植體的處理 

　　對外植體設計4種不同的處理方式：①將外植體用剪刀剪成所需長度或大小（嫩芽長約2 cm；帶節莖段約2.5 cm、葉片大小為1 cm2，以下同）後，進行消毒和接種作為對照組；②在接種的培養基中添加濃度為0.1%的活性炭；③外植體切成所需大小後於冰箱4℃低溫下預處理5 d再進行接種；④將外植體用燒紅的手術刀快速切割成所需大小後進行接種。

　　1.2.2  外植體的消毒和接種 

　　將外植體於洗衣粉水中浸泡20 min，流水衝洗1～2 h，接種前先在75％的酒精中浸泡20～30 s，無菌水衝洗3次後根據外植體不同類型用0.1％的升汞處理6～15 min，再用無菌水衝洗4次，在無菌條件下接種到培養基上，每瓶接種1個外植體，每一處理接種30瓶。每隔25～30 d繼代1次。

　　1.2.3  培養基的設計
 
　　B5為基本培養基，附加3％的蔗糖和0.7％的瓊脂。誘導芽的培養基為：① BA1.0+NAA0.01+IBA0.1；② BA3.0+NAA0.01+IBA0.1；③BA5.0+NAA0.01+IBA0.1；誘導愈傷組織的培養基為：④2,4-D1.0+BA0.1；⑤BA3.0+NAA0.05+IBA0.1；⑥BA3.0+NAA0.1+IBA0.1；⑦BA5.0+NAA0.1+IBA0.1（單位：mg/L）。培養基滅菌前將pH值調至5.8～6.0。

1.2.4  培養條件 

　　暗培養7 d後再轉為光照培養，光照時間12 h/d，光強1 500～2 000 Lx。培養溫度為（25±2）℃。

　　1.2.5  實驗結果的統計和計算 

　　每一處理在接種後定期觀察、記錄外植體的動態和生長情況，在培養30 d分別統計接種數、褐變率、出愈數、出芽數、誘導率（注：接種數為去除汙染後的數量，褐變率為褐變數與無汙染的接種數的比值，誘導率為出愈數或出芽數與無汙染的接種數的比值）。

　　2  結果

　　2.1  青錢柳不同外植體與芽的誘導的關係

　　本試驗將嫩芽、莖段和嫩葉分別接種於培養基中，比較不同外植體誘芽情況，（見表1）。由表1可見，青錢柳的嫩芽、嫩葉均不能夠直接誘導芽的產生，帶節莖段在接種約7 d時葉柄基部有腋芽萌動，14 d時可見嫩綠的單芽長約0.4 cm，30 d時芽長為0.8 cm。說明同種植物的不同部位外植體誘導芽產生的能力是不同的。
  
　　在植物組織培養中，植物激素對器官的分化調節起重要作用，就形態學而言6-BA能夠促進芽的分化［7］。從表1可見，誘導青錢柳芽抽生的適宜6-BA濃度為3.0 mg/L，誘導率為29.17％；BA為1.0 mg/L雖然可以誘芽，但誘芽率低，為4.35％；6-BA為5.0 mg/L則不能誘導芽的抽生。說明在誘導芽的生成時6-BA的濃度是一個關鍵因素，濃度過低誘芽率偏低，過高則抑製芽的抽生。
表1  青錢柳不同外植體與芽的誘導的關係（略）

　　2.2  不同季節采集的莖段對芽的誘導的影響將於春季、夏季和秋季采集的青錢柳莖段接種於BA3.0+NAA0.01+IBA0.1的培養基中，結果表明，春季采集的莖段能夠誘導芽的抽生，出芽率可達29.17%；夏、秋兩季采集的莖段出芽率和出愈率都比較低，且褐變率都大於50.00％（分別為82.61％和90.48％，見表2）。說明在春季采集不僅莖段的褐變率較低，而且更容易誘導腋芽的抽生和愈傷組織的形成。表2  不同季節的莖段對芽的誘導的影響（略）

　　2.3  不同激素組合對青錢柳愈傷組織的誘導效果的影響將嫩芽、莖段、嫩葉接種在不同激素組合的培養基中,不同外植體誘導產生愈傷組織的情況見表3。由表3可見，嫩葉在⑦號培養基上，其出愈率最好，最高可達93.33％；適合嫩芽誘導最高出愈率（為86.67％）的培養基為④號，適合莖段誘導出較高出愈率的培養基為⑥號（出愈率為42.85％）。說明不同激素組合的培養基均可誘導外植體產生愈傷組織，但不同外植體在不同培養基中誘導產生愈傷組織的效果不同。
   
　　表3結果還表明，不同外植體均可誘導產生愈傷組織，但其誘導產生愈傷組織的能力有差異，莖段的出愈率則比較低，最高僅為42.85％，嫩葉和嫩芽產生愈傷組織的效果較好，出愈率都高於60％，尤其是嫩葉，出愈率可達93.33％。說明幼嫩的外植體在愈傷組織的誘導方麵具有優勢，適合誘導愈傷組織的外植體為嫩葉和嫩芽。表3  不同激素組合的培養基與愈傷組織誘導的效果（略）

　　2.4  外植體的不同處理方式與褐變的關係在木本植物的組織培養過程中，褐變的問題是普遍存在的，因此有人認為褐變能否得到有效的控製是植物組織培養能否成功的關鍵［8］。胡冬南等［9］人報道青錢柳組織培養過程中無褐變現象，本實驗對外植體進行了不同的處理，發現不同外植體在培養過程中存在褐變現象，但褐變程度不同：莖段褐變率最高，可達100%；嫩芽的褐變率較低；嫩葉幾乎不存在褐變現象。說明不同類型外植體其酚類含量不同，越幼嫩的組織其含量越少，在組織培養中越不容易出現褐變現象。見表4。
   
　　本實驗為探討減少組織培養中莖段的褐變率，對外植體設計了4種不同的處理方式，結果表明，對照外植體在培養過程中有一定程度的褐變；將外植體先於4℃低溫預處理5 d和直接用燒紅的手術刀快速切割外植體後再進行接種可有效減少外植體的褐變率。分析其原因可能放置於4℃冰箱中，可使酚類物的氧化進程變慢，同時預處理5 d則有利於外植體切口愈合，在培養時可減少酚類物質的外溢；用燒紅的手術刀片切割可以減少褐變，其原因尚不清楚。表4  不同處理方式與褐變的關係（略）

　　3  討論

　　青錢柳的生理功用和藥用價值已經引起人們的重視，探討青錢柳的速繁途徑和建立良繁體係成為目前迫切解決的問題。本試驗研究表明,不同類型的青錢柳外植體在芽及愈傷組織的誘導率方麵存在明顯差異。就芽的誘導而言，春季采集的莖段在B5+6-BA3.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +IBA0.1 mg/L的培養基上能夠較好地誘導腋芽的抽生，其誘導率為29.17％；適合誘導青錢柳愈傷組織的外植體為嫩芽和嫩葉，適合培養基分別為B5+2,4-D1.0 mg/L +BA0.1 mg/L和B5+BA5.0 mg/L +NAA0.1 mg/L +IBA0.1 mg/L。

　　青錢柳組織培養中存在褐變問題，莖段的褐變情況最為突出，嚴重影響了芽及愈傷組織的誘導，防止褐變的方法在其他植物方麵也有很多報道，本實驗采取將外植體先於4℃低溫預處理5 d後再進行接種能夠有效減少外植體的褐變率；另外本實驗首次采用燒紅的手術刀對外植體進行切割再接種的方法，可將莖段的褐變率由100％降低至55.55％，為解決青錢柳的褐變問題提供了一種新的思路。

以上實驗獲得了大量較疏鬆、顆粒狀、黃綠色愈傷組織和綠色致密的愈傷組織及一些青錢柳新芽，通過每隔25～30 d繼代1次，愈傷組織能夠一直保持活力；所誘導產生的新芽有部分在培養過程中卻出現了新生葉子脫落或不同程度的褐變現象，影響了青錢柳的快速繁殖。因此，研究減少青錢柳組織培養中出現的褐變現象及如何從愈傷組織中誘導植株的再生，成為了今後重點解決的問題。

作者：吳群英 徐慶 李麗亞 梁榮感 龔受基《時珍國醫國藥》

【參考文獻】
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　　［3］郭春蘭，楊武英，胡東南，等.青錢柳嫩枝扡插育苗等研究［J］.江西農業大學學報，2006，28(2)：254.
　　［4］徐 慶，宋芸娟.青錢柳的研究概況［J］.華夏醫學，2004，17（3）：451.
　　［5］尚旭嵐，徐錫增，方升佐.青錢柳離體胚的培養及快速繁殖［J］.南京林業大學學報（自然科學版）， 2007，31（1）：101.
　　［6］上官新晨，郭春蘭，楊武英，等. 培養基及培養條件對青錢柳愈傷組織生長和黃酮含量的影響［J］.福建農林大學學報（自然科學版），2006，35（6）：588.
　　［7］Song,J.T., Choi,J,N., Song,S,I., et al Identification of a potexvirus in Korean garlic plants［J］.Agricultural chemistry and Biotechnolohy,1995,38(1):55.
　　［8］孔祥生，張妙霞，杜愛玲，等.甜柿離體快繁技術研究［J］.華中農業大學學報，1998，17（2）：178.
　　［9］胡冬南，蔣 豔，吳少福，等. 青錢柳組織培養的初步研究［J］.江西農業大學學報，2005，27（1）：39.

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