血清芽管實驗檢測白假絲酵母菌的藥物敏感性

【摘要】  目的了解泌尿生殖道感染白假絲酵母菌對黃連、黃芩、七葉一枝花和氟康唑注射液的敏感性，為臨床有效控製其感染提供依據。方法采用白假絲酵母菌芽管藥敏試驗法，測定黃連、黃芩、七葉一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液對從泌尿生殖道感染標本中分離出的52株白假絲酵母菌芽管的最低抑製濃度。結果黃連、黃芩、七葉一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液，在一定的濃度下對泌尿生殖道感染白假絲酵母菌芽管有明顯的抑製作用，其抑製芽管的最低濃度分別為1.25，5，2.5 mg/ml和0.125 mg/ml。結論 白假絲酵母菌芽管藥敏試驗法，可為臨床快速篩選敏感藥物；黃連、黃芩、七葉一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液對白假絲酵母菌有較好的抗菌活性。

【關鍵詞】  血清芽管試驗 白假絲酵母菌 黃連 黃芩 七葉一枝花 氟康唑注射液 藥物敏感性抗菌活性

白假絲酵母菌（Candida albicans）又稱白色念珠菌，是常見的條件致病性真菌，其既可引起皮膚粘膜的感染，又可致內髒器官及中樞神經的感染［1］。近年來，隨著廣譜抗生素、皮質類固醇激素和免疫抑製劑的被廣泛應用，白假絲酵母菌感染呈上長趨勢，並已躍居深部真菌感染的首位［2］。且耐藥菌株逐年增加，給臨床治療帶來極大困難。為了能及時向臨床提供敏感藥物，治療白假絲酵母菌感染並減少耐藥菌株的產生和播散，我們參照唐書謙等［3］推薦的白念珠菌芽管法藥敏試驗新方法，用黃連、黃芩、七葉一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液對白假絲酵母菌進行藥物敏感性試驗。現將結果報告如下：

    1  材料與方法

    1.1  菌株  52株白假絲酵母菌分離自贛南醫學院第一附屬醫院門診送檢的119例泌尿生殖道感染患者。

    1.2  藥物來源  黃連、黃芩、七葉一枝花由贛南醫學院第一附屬醫院中藥房提供。氟康唑注射液：2mg /ml，廣東太陽神集團荔城製藥廠，批號03061311）。

    1.3   藥物提取方法  取黃連、黃芩、七葉一枝花各200 mg，分別加適量50%乙醇浸泡12 h，然後80°C水浴箱中熱浸4 h，濾去藥渣，濾液用文火濃縮至10 ml，製成濃度為20 mg/ml的藥液備用。

    1.4  實驗方法

    1.4.1  試驗管 氟康唑注射液和黃連、黃芩、七葉一枝花提取物分別用生理鹽水倍比稀釋6次，氟康唑注射液濃度為2～0.031 25 mg/ml，黃連、黃芩、七葉一枝花提取物濃度為20～0.312 5 mg/ml。再分別取7種藥物稀釋液各0.5 ml加入盛有0.5 ml新鮮兔血清的試管中，混勻。

    1.4.2  對照管  0.5 ml生理鹽水加0.5 ml新鮮兔血清混勻。

    1.4.3  菌液接種  以上各管分別接種5×107CFU/ml白假絲酵母菌20 μl混勻，置37°C溫箱內孵育3 h後取出觀察。

    1.5  結果判斷

    1.5.1  鏡檢芽管數與芽管生長的長度  將芽管數、芽管生長的長度與對照管比較，一般超過菌體直徑2倍以上，為正常生長芽管。芽管長度小於或等於菌體直徑者，為受抑製芽管。

    1.5.2  芽管計數  按白細胞計數法，分別計算出以上4種藥物7種不同稀釋濃度出現的正常芽管和受抑製芽管的數量。

    1.5.3  藥物敏感性判斷  無芽管生長者為敏感；有芽管生長，若受抑製芽管在100%以上者，為中度敏感；若受抑製芽管在50%左右者為輕度敏感；若與對照芽管長度基本一致者為不敏感。

2  結果

    2.1  不同藥物抑製芽管試驗的敏感性比較結果見表1～4。結果表明黃連、黃芩、七葉一枝花50%乙醇提取物和氟康唑注射液，在一定的濃度下對泌尿生殖道感染白假絲酵母菌芽管有明顯的抑製作用，其抑製芽管的最低濃度分別為1.25，5，2.5 mg /ml和0.125 mg /ml。

    2.2  對照試驗　芽管生長正常，一般超過菌體直徑2倍以上。表1  氟康唑注射液對52株白假絲酵母菌的抗菌活性 氟康唑注射液 表2  黃連對52株白假絲酵母菌的抗菌活性表3  黃芩對52株白假絲酵母菌的抗菌活性黃芩濃度 表4  七葉一枝花對52株白假絲酵母菌的抗菌活性七葉一枝花濃度

    3   討論

    隨著係統性真菌感染及耐藥菌株的不斷增多，借助藥敏試驗進行抗真菌藥物的選擇越來越被人們所關注［4］。本實驗采用唐書謙等［3］推薦的白念珠菌芽管法藥敏試驗新方法，將一定濃度的黃連、黃芩、七葉一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液與血清混合，再接種一定量的菌液，置37℃溫箱內孵育2～3 h，觀察白假絲酵母菌芽管的生長情況，最終評估該藥對白假絲酵母菌芽管的抑製程度。該法與瓊脂擴散法相比，可縮短孵育時間(因常規白假絲酵母菌37℃孵育需48 h，現隻需孵育2～3  h)，能快速篩選出對白假絲酵母菌有效的藥物，這對泌尿生殖道白假絲酵母菌感染患者能及時得到有效治療具有重要的臨床價值。

    本實驗結果表明不同菌株的白假絲酵母菌對藥物的敏感性存在差異。從表1可看出，氟康唑注射液抑製芽管的最低濃度為0.125 mg/ml。由於該藥能特異、有效地抑製真菌的甾醇合成，可在全身組織廣泛分布，半衰期較長，約為35.4 h，每日僅需用藥1次，且耐藥率較低，是目前醫院治療真菌感染的常用藥物。

    3種常用中草藥對白假絲酵母菌芽管試驗中，以黃連效果最好，其次為七葉一枝花，第三為黃芩，它們抑製芽管的最低濃度分別為1.25 ，2.5和5 mg/ml，與馬廉蘭等［5］報道采用瓊脂擴散法所測的最低抑菌濃度有差異，但本文所測抑製芽管的最低濃度與馬廉蘭等報道的最低抑菌濃度成正相關。

    白假絲酵母菌以出芽繁殖，其結構複雜，細胞壁的主要成分為多糖，在酵母相以葡聚糖為主，在菌絲相以幾丁質為主，幾丁質在酵母相中主要位於母細胞的芽痕處，是組成母子細胞間隙的主要成分，也是酵母菌出芽時的必要成分，酵母相轉化為菌絲相時幾丁質的合成增加3～4倍［6］。因此推測出芽抑製機理是否為藥物作用白假絲酵母菌的某些細胞壁合成酶(如幾丁質合成酶)，有待進一步探討。

作者：鍾有添 黃真 王小麗 馬廉蘭 《時珍國醫國藥》

【參考文獻】
  ［1］ 陸德源.醫學微生物學，第5版［M］.北京：人民衛生出版社，2001：237.
［2］ Cardenas-Freytag L,Cheng E,Mayeux P,et al.Effect-iveness of a vaccine composed of heat-killed Candida albicans and a novel mucosal adjuvant,LT(R192G),against systemic candidiasis［J］.Infect Immun.1999,67(2) ：826.
［3］ 唐書謙，廖 軍，鍾白玉，等.白念珠菌芽管法藥敏試驗新方法［J］.第三軍醫大學學報，2003,25(9):825.
［4］ National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A［J］.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997：1.
［5］ 馬廉蘭，鍾有添.六種中草藥對深部感染真菌的體外抑菌效果［J］.贛南醫學院學報，2001,21(3):1.
［6］ 聞玉梅.現代醫學微生物學［M］.上海：上海醫科大學出版社，1999：678.

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