青藏鐵路沿線鼠疫菌生物學性狀的研究

【摘要】  目的 研究並檢測青藏鐵路沿線鼠疫菌生物學性狀。方法 選擇青藏鐵路沿線鼠疫菌的生物化學試驗、毒力因子、營養型、毒力、質粒、外膜蛋白和鼠疫菌對抗生素敏感性等項目。結果試驗用青藏鐵路沿線菌株生化性狀為甘油＋、鼠李糖－、阿膠糖＋、密二糖－、麥芽糖＋、脫氮＋等主要特征；具有鼠疫菌莢膜抗原(Fra I+ )、毒力抗原 (Vwa+ )、鼠疫菌素 I(Pst I+ )、色素沉著因子 (Pgm+ ) 4種毒力因子；對小白鼠的LD100在102～103個菌，LD50為7.94～31.62個菌，對豚鼠的LD100在105～107個菌，LD50為68.14～685.49個菌；營養型表現為對Trp、Thr、Leu、Arg不依賴，而對Phe、Met、Cys依賴，對Ile和Glu表現出低營養；攜帶6、45、52、65、92 Mdal質粒；在10%的SDS-PAGE上37℃條件下的培養物可表達26條外膜蛋白帶，28℃培養物可表達36條外膜蛋白；部分頭孢類和喹諾酮類藥物對試驗菌株的敏感性效果較好，19種抗生素均較鏈黴素為佳。結論青藏鐵路沿線的鼠疫菌屬於典型的青藏高原型菌株，都是強毒型鼠疫菌，該項研究可為青藏鐵路沿線的鼠疫防治措施提供科學的依據。

【關鍵詞】  青藏鐵路沿線；鼠疫菌；生物學性狀；質粒；外膜蛋白

    A study on biological character of the Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway

    【Abstract】  Objective  To study and detect the biological character of the Yersinia pestis along the Qinghai-Tibet railway.Methods  To choice the Yersinia pestis biochemistry、virulence、nutrition、plasmid、outer membrane proteins、antibiotic sensitivity test.Results  The Y.pestis biochemistry character: glycerol +、rhamnose -、melibiose -、maltose +、denitrification +;there are FraI +、Vwa +、Pst I +、Pgm +;in animal experiment the white mouse LD100:102～103,LD50:7.94～31.62,the cavy LD100:105～107,LD50:68.14～685.49;the Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway depend on Phe、Met、Cys,did not depend on Trp、Thr、Leu、Arg and showed meiotroph of Ile、Glu;contains the plasmid of 6、45、52、65、92Mdal;there are 26 stripes of outer membrane proteins at 37℃ and 36 stripes at 28℃ in 10% SDS-PAGE electrophoresis;the Yersinia pestis is sensitive to some of cephalosporin and carbostyril,19 antibiotics is better than streptomycin.Conclusion  The Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway is standard strain of Qinghai-Tibet plateau ecotype,the research might provide scientific evidence for prevention and control of plague along the Qinghai-Tibet railways.

    【Key words】  along the Qinghai-Tibet railways;the Yersinia pestis;biological character;plasmid;the outer membrane proteins

    青藏鐵路是我國西部大開發的標誌性工程。青藏鐵路沿所經過的青海海晏、剛察、天峻、烏蘭、格爾木以及西藏的安多、那曲、當雄等縣市均是鼠疫疫源地，也是人及動物鼠疫頻發的地區。由於這一地區鼠疫菌具有獨特的生物學特性，決定了人類和動物感染鼠疫後發病急、病情重、病程短、傳染性強、病死率高，對人群和社會的危害非常嚴重。

    本項目主要從青藏鐵路沿線鼠疫菌的生化特性、營養需求、毒力、毒力因子、質粒、外膜蛋白以及對抗生素敏感性七個方麵進行試驗研究，其目的是深入細致地了解該地區鼠疫菌生物學特征。以便為青藏鐵路沿線鼠疫的防治提供科學依據。

    1  材料與方法

    1.1  菌株  分離到青藏鐵路沿線18株強毒鼠疫菌，對照菌株有141標準菌株、EV菌、51041吉林省黃鼠菌株、02051青海省喜馬拉雅旱獺菌株、32001西藏喜馬拉雅旱獺菌株、87001雲南黃胸鼠菌株和假結核05菌株(見表1),和EV菌攜帶6、45、65 Mdal質粒。表1  試驗用菌株

    1.2  方法及培基

    1.2.1  生化試驗  按照常規試管法［1］，包括甘油、鼠李糖、阿膠糖、密二糖、麥芽糖、脫氮等16項試驗。

    1.2.2  毒力因子檢查  鼠疫杆菌素I(PstI)檢查按史書文介紹的方法［2］，指示菌為血清型I型假結核菌；Vwa抗原檢測按文獻［1］方法，采用草酸鎂培養基；莢膜抗原FraI檢查  用反相血凝方法；色素沉著因子(Pgm)檢查用剛果紅培養基。

    1.2.3  營養需求檢測  按照何永山等［3］ 記述的方法進行，選用 Lawto氏最小培養基。

    1.2.4  鼠疫菌毒力測定  對小白鼠和豚鼠采用常規的動物接種試驗，計算各試驗菌株的絕對致死量（LD100）和半數致死量（LD50）。

    1.2.5  鼠疫菌質粒檢測  采用Kado和Liu法提取鼠疫菌的質粒，經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

    1.2.6  鼠疫菌外膜蛋白檢測  鼠疫菌經破碎後采取超高速離心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳係統分離鼠疫菌外膜蛋白。

    1.2.7  鼠疫菌對抗生素敏感性測試  采用紙片法，應用20種抗生藥物對青藏鐵路沿線鼠疫菌進行敏感性測試。

    2  結果

    2.1  生化試驗  試驗用青藏鐵路沿線菌株表現為甘油＋、鼠李糖－、阿膠糖＋、密二糖－、麥芽糖＋、脫氮＋等主要特征，見表2。

    2.2  毒力因子檢查  通過試驗證實，試驗用青藏鐵路沿線菌株都具PstI+、VWa+、FraI+、Pgnn+ 4種毒力因子，見表3。表2  試驗用菌株生化測試結果表3  毒力因子檢查結果   

    2.3  營養需求檢測  試驗結果表明，試驗用青藏鐵路沿線菌株在Lawton氏最小培養基上或加入色氨酸（Trp）、蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）都可生長；從Lawton氏最小培養基中減去異亮氨酸（Ile）、穀氨酸（Glu）也能生長，但從Lawton氏最小培養基中減去苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys）不能生長。說明試驗用青藏鐵路沿線菌株對Trp、Thr、Leu、Arg不依賴，而對Phe、Met、Cys依賴，對Ile和Glu表現出低營養，見表4。

    2.4  鼠疫菌毒力測定

    2.4.1  鼠疫菌對小白鼠的毒力  試驗用的6株鼠疫菌對小白鼠均有較強的毒力，絕對致死量（LD100）在102～103個菌，半數致死量（LD50）為7.94～31.62個菌，見表5。

    2.4.2  鼠疫菌對豚鼠的毒力  試驗用的6株青藏鐵路沿線鼠疫菌對豚鼠同樣具有很強的毒力，絕對致死量（LD100）在105～107個菌，半數致死量（LD50）為68.14～685.49個菌，見表6。表4  營養需求試驗結果注：+生長（不依賴），    －不生長（依賴）表5  試驗菌株對小白鼠毒力試驗結果

2.5  鼠疫菌質粒檢測  經試驗研究證明，青海省天峻縣、烏蘭縣、剛察縣、海晏縣12株鼠疫菌中有11株攜帶6、45、52 Mdal質粒，其中青海省烏蘭縣1株鼠疫菌攜帶6、45、65 Mdal質粒，見圖1。青海省格爾木和西藏那曲鼠疫菌攜帶6、45、92 Mdal質粒。由此，可繪製出青藏鐵路沿線鼠疫菌攜帶6、45、52 Mdal,6、45、65 Mdal和6、45、92 Mdal 3種質粒圖譜，見圖2、圖3。圖1  試驗用菌株質粒檢測結果

    菌株從左至右：1EV、2～4青海天峻、5吉林黃鼠、6～8青海烏蘭、9～11青海剛察、      12～13青海海晏、14青海祁連圖2  試驗用菌株質粒檢測結果       

    菌株從左至右：1EV、2吉林長嶺、3青海祁連、4西藏紅海、5青海天峻、6烏蘭、7剛察、8海晏、9青海格爾木、10西藏那曲、11青海天峻、12烏蘭、    13海晏、14雲南瑞麗 圖3  試驗用菌株質粒檢測結果

    菌株從左至右：1EV、2青海祁連、3西藏紅海、4～6西藏那曲、

    7～9青海格爾木、10青海剛察、11青海海晏、12西藏紅海、

    13吉林長嶺、14雲南瑞麗2.6  鼠疫菌外膜蛋白檢測  試驗用的青藏鐵路沿線鼠疫菌在10%的SDS-PAEG上，37℃條件下的培養物所表達的外膜蛋白為26條蛋白帶，其分子量分別是：119、116、111、103、97、94、90、87、84、79、73、70、65、62、58、52、47、42、39、36、34、32、30、29、26、24KD，見圖4。 圖4  試驗用菌株37℃外膜蛋白檢測結果

    菌株從左至右：1EV、2～3青海天峻、4～5青海烏蘭、6～7青海剛察、8～9青海海晏、10～11青海格爾木、12～13西藏那曲、14 EV、15Mark

    在同樣電泳條件下28℃培養物表達的外膜蛋白為36條蛋白帶，其分子量分別是：119、116、111、103、97、94、90、87、80、73、70、68、65、62、58、56、53、50、48、47、42、39、38、36、35、34、32、30、29、27、26、25、24、22、19、16 KD，見圖5。圖5  試驗用菌株28℃外膜蛋白檢測結果

    菌株從左至右：1EV、2～3青海天峻、4～5青海烏蘭、6～7青海剛察、8～9青海海晏、10～11青海格爾木、12～13西藏那曲、14 EV、15Mark

    2.7  鼠疫菌對抗生素敏感性測試  通過對18株鼠疫菌的藥敏試驗，結果表明，我們試驗用的21種抗生素對鼠疫菌的藥敏結果均較鏈黴素為佳。具體敏感程度的順序為：PIP＞CB＞CTX＞CF＞CRO＞LMF＞ENO＞CIP＞NOR＞GTF＞CFP＞CFX＞FLE＞AM ＞OFL＞CPM＞CMZ＞PEF＞CEP＞SXT＞S。具體試驗結果詳見表7。表7  鼠疫菌對抗生素敏感性試驗結果注:(1)表內數據為18株鼠疫菌所得結果之平均值； (2)藥敏紙片直徑6mm

    3  討論

    研究鼠疫菌的生物性狀可以直接反映鼠疫菌對宿主的致病性及其在流行病學中的意義。作為一個獨立類型的鼠疫自然疫源地其中一個主要的因素就是要有一個和主要宿主相互適應的鼠疫菌，以便此類型鼠疫在該疫源地長期保存的流行，形成鼠疫的自然疫源性［4］。

    鼠疫菌的生化特性主要與宿主、媒介及其地理環境等因素有關，是地理環境生物群落綜合作用長期自然進化選擇的結果。在我國宋延富依據鼠疫菌生化試驗，將我國鼠疫菌劃分為12個生物型。各生物型有特定的地理分布，可以表現出不同疫源地內不同型鼠疫菌生化特征［5］。紀樹立等對我國11個省、自治區分離的418株鼠疫菌進行糖醇酵解，脫氮，營養型等，將我國鼠疫菌分成l7個生態型。17個型鼠疫菌均各有特定的地理位置，對人的侵襲力、致病性亦各有不同［6］。

    分離自青藏鐵路沿線的鼠疫菌也同樣反映出其宿主生理條件、地理分布與生化性狀的關係。從試驗結果可以看出，青藏鐵路沿線的鼠疫菌的生物學性狀具有獨自的特點，即表現為甘油＋、鼠李糖－、阿膠糖＋、密二糖－、麥芽糖＋、脫氮＋；具有野生強毒菌所特有的PstI＋、VWa＋、FraI＋、Pgnn＋ 4種毒力因子；對小白鼠的半數致死量為7.94～31.62個菌，對豚鼠的半數致死量為68.14～685.49個菌，雖然試驗用的菌株毒力存在差異，但對小白鼠和豚鼠均有較強的毒力，青藏鐵路沿線的鼠疫菌都是強毒型鼠疫菌；該地區鼠疫菌的營養需求表現出對色氨酸（Trp）、蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）不依賴，而對苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys）依賴，對異亮氨酸（Ile）、穀氨酸（Glu）表現出低營養；試驗所用青藏鐵路沿線18株鼠疫菌，攜帶的質粒種類有6、45 Mdal，大質粒分別為52 Mdal或65 Mdal或92 Mdal。

    鼠疫菌能分泌一組由溫度調控、PCD1質粒編碼的高標準表達的毒力蛋白（Yops）和V抗原（LcrV），其合成與分泌的條件是，在體外缺鈣、37℃條件下合成並分泌Yops和LcrV產物，這一分泌過程由Ⅲ型分泌係統調控［7］。本試驗對青藏鐵路沿線不同疫源縣的12株鼠疫菌進行了外膜蛋白研究，發現各疫源縣鼠疫菌具有共同的外膜蛋白帶。但37℃條件下和28℃條件下所產生的外膜蛋白帶不同。根據張春華［8］等關於鼠疫菌外膜蛋白分型的報道可將試驗用的菌株劃歸為YOP1型。

    本項研究較全麵地開展青藏鐵路沿線鼠疫菌生物化學特性、營養需求、毒力、毒力因子、質粒、外膜蛋白等生物學性狀和藥物敏感性的研究。根據該項研究結果，在鼠疫治療中可以考慮使用頭孢類藥物、喹諾酮類藥物及羧苄青黴素等新型抗生素來取代鏈黴素，預防性投藥選用口服藥物磺胺甲惡唑/甲氧苄啶為佳。該研究結果可為青藏鐵路沿線鼠疫的防治及其製定監測技術措施和臨床治療提供鼠疫病原學方麵的科學依據。

 作者：張春華，呂景生，叢顯斌，趙 斌，王忠惠，張市，邵奎東《中華醫學研究雜誌》

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7 Day JB, Ferracci F, Plano GV.Translocation of YopE and YopH intoeukaryotic cells by Yersinia pestis yopH,tyeA,sycN,yscB and LcrG deletion mutants measured using a phosphorylatable peptide tag and phosphospecific antibodies. Mol Microbiol,2003,47(3):807.
8 張春華,叢顯斌, 王忠惠，等. 中國鼠疫菌外膜蛋白種類及在基因分型中的應用.中國地方病防治雜誌，2005，20（4）：193.

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