摘要 單核細胞增生李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌,廣泛分布於自然界。針對目前單核細胞增生李斯特氏菌的檢測現狀,總結了4種現行有效的常用檢測方法,並對各種檢測方法的優缺點進行了分析比較。實時熒光定量PCR檢測技術,可精確定量、反應迅速、信號重複性好、靈敏度和特異性高,不需要凝膠電泳過程,避免了擴增產物對環境造成的汙染問題,將是未來分析檢測發展的一個主要趨勢。
關鍵詞 單核細胞增生李斯特氏菌;傳統檢測方法;酶聯免疫技術;分子生物學技術
單核細胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes 簡稱L.M;單增李氏菌)是一種人畜共患病病原菌[1],使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血症及造成懷孕婦女流產、死胎等疾病。近年來國外報道該菌所致的食物中毒越來越多,病死率高達30%~70%[2-3]。國內也不斷有散發病例,引起了國內醫學界的普遍關注。WHO在20世紀90年代已將其列為食品四大致病菌之一[4-5]。該菌在自然界分布廣泛,以家畜、家禽獸為主要宿主,很容易汙染食品而引起食物中毒和李斯特病暴發[6-7]。食品是導致人類受單核細胞增生李斯特氏菌感染的主要傳播途徑,該菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌。在絕大多數食品中都能找到李斯特氏菌,肉類、蛋類、禽類、海產品、乳製品、蔬菜等都已被證實是李斯特氏菌的感染源[8]。隨著我國冷藏、速凍食品消費量的迅速增多,食品中單增李斯特氏菌的潛在危險性也越來越突出,因此在食品衛生微生物檢驗中,必須加以重視。現針對其常用檢測方法的優缺點進行分析比較。
1傳統檢測方法——分離培養
我國於1994年開始發布單核細胞增生李斯特氏菌檢測的國家標準,即GB/T4789.30-1994。目前,很多檢測部門和單位在進行食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測時,其主要依據依然是國標法。國標GB/T4789.30-1994自從頒布以來,分別進行了3次修訂,分別是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至現在正在實行中的GB/T4789.30-2010版本。修訂後的GB/T4789.30-2010法,對於樣品檢測依次進行增菌、選擇性分離平板分離培養、初篩試驗、鑒定等步驟,通過增加API鑒定試驗代替生化試驗和協同溶血試驗。雖然近年來顯色培養基的應用和ATB生化鑒定儀的聯合使用已大大簡化了鑒定步驟,縮短了檢測周期,但由於ATB生化鑒定儀鑒定單核細胞增生李斯特氏菌主要依據10種生化反應(主要為糖發酵),結果的判定主要是依據顏色變化,因此顏色變化不明顯或者不好界定時,其陰陽性判定帶有一定的主觀性。而且使用的API試條和試劑質量必須是符合有關的要求。另外,由於需要二次增菌、平板分離及生化鑒定,整個過程至少需要4~5 d。總之,傳統單核細胞增生李斯特氏菌分離鑒定方法耗時長、程序繁瑣、試劑和人力成本都比較高。
2免疫學檢測技術
由於細菌菌體和鞭毛抗原的存在,使得人們可以建立基於抗原-抗體反應的方法來檢測食品中的致病菌。目前,從食品中檢測單核細胞增生李斯特氏菌的免疫學方法主要是ELISA技術,國標GB/T4789.30-2008中也曾將這一方法列為可供選擇的檢測方法之一。其檢測原理主要是將抗原或抗體結合到固相載體表麵,再將抗原或抗體特定基團與酶交聯成酶結合物,當酶結合物同相應的抗原或抗體結合後,則形成酶-抗原抗體複合物;當酶遇到相應的底物時,可以催化產物水解、氧化或還原,從而產生有色物質。檢測時根據有色物質的有無及其深淺,即可間接推斷被檢樣品中有無相應抗原或抗體存在和數量多少,從而達到定性和定量檢測的目的。Farber等[9]於1987年首先報道了針對單核細胞增生李斯特氏菌鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗程序,應用這一程序,可以在2~3 d內從自然汙染的樣品中檢出單核細胞增生李斯特氏菌。在國內方麵,範紅結等[10]在1998年研究獲得了3株針對單核細胞增多性李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和格氏李斯特氏菌菌體表麵蛋白的單克隆抗體,與其他李斯特氏菌和屬外菌株不發生反應,為建立LM免疫學檢測技術奠定了基礎。單核增多李斯特氏菌的免疫學方法主要是ELISA技術,具有操作簡便、通量高的特點,可在同一時間內檢測大量樣品,並可將純肉湯培養物中的分離物進行屬水平的鑒定。但由於菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在,還難以進行李斯特氏菌種間特異分析。同時,由於單核細胞增生李斯特氏菌表麵抗原極其豐富,且大部分優勢表位與屬內外細菌有廣泛的交叉抗原,給篩選特異性單克隆抗體帶來一定的困難,增加了假陽性結果的幾率。因此,用ELISA方法從增菌培養物中篩選李斯特氏菌,一般還需要在選擇性分離平板上劃線培養,這同時也延長了檢測周期。
3分子生物學方法
3.1傳統PCR方法
目前,應用分子生物學技術檢測單核細胞增生李斯特氏菌是一個不斷探討和深化的方向,國外已經開展了大量的研究工作。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain Reaction,PCR)最早由Mulhs和Cetus公司的同事於1985年發明的,是一種通過在體外模擬自然DNA複製過程快速擴增特定DNA序列的方法。隨著對單核細胞增生李斯特氏菌研究的不斷深入,人們已經積累了大量有關單核細胞增生李斯特氏菌的資料,許多重要的致病因子如溶血素O、內化素、增溶血因子、磷脂酶、鐵蛋白、熱休克蛋白、過氧化氫酶及超氧化物歧化酶等已經分離提純,其編碼基因序列也已被克隆測序。Bessesen MT等[11]於1990年建立了PCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法,通過擴增李斯特氏菌溶血素基因hlyA中386 bp的PCR方法檢測單核細胞增多性李斯特氏菌,DNA檢測量為25 ng,即1 000個菌體。薑永強等[12]在應用PCR方法對單增李斯特氏菌進行檢定的基礎上,作了如下改進:用微孔板雜交法檢測單增李斯特氏菌溶血素(Lister-MysinO)編碼基因hlyA片段,使特異性和敏感性大大提高;通過化學抽提的方法製備模板,可較好地避免食物成分的抑製。
3.2實時熒光定量PCR檢測技術
實時熒光定量PCR檢測技術是在傳統PCR檢測技術的基礎上發展起來的核酸定量技術,它通過在PCR反應體係中加入熒光基團,利用熒光信號的累積實時監測整個PCR進程,並根據檢測CT值推斷目的基因的初始量。1995年,Bassler HA等[13]最早建立了用於單核細胞增生李斯特氏菌檢測的熒光定量PCR體係,將熒光定量PCR技術應用於單核細胞增生李斯特氏菌檢測,該體係以hlyA基因為檢測靶點,設計合成了相應的檢測探針,檢測靈敏度為50 cfu反應。徐德順等[14]在常規PCR方法檢測單增李斯特氏菌的基礎上,利用特異性探針法自行設計與建立了實時熒光定量PCR檢測方法,對40份食品樣品中單增李斯特氏菌進行了檢測,其靈敏度達到了隻需19個細菌就可以得到陽性結果,且檢測速度快,包括核酸提取在內整個檢測時間僅為3 h左右,比傳統細菌培養法和常規PCR法所需時間大大縮短,結果更為直觀,靈敏度也更高。
另外,孫烯等[15]又建立了基於SYBRGREEN染料的單核細胞增多性李斯特氏菌的熒光定量PCR檢測方法,並利用此方法檢測人工汙染的牛奶中單核細胞增生李斯特氏菌菌量,結果表明檢測靈敏度約為100 cfu反應。劉仲敏等[16]將單增李斯特氏菌實時熒光定量檢測技術應用於批量樣品的檢測,從加樣到結果隻需要2 h左右,不但保留了常規檢測的特異性和敏感性,還可同步完成多達96個樣品的擴增及定量,適宜於大批樣品的檢測處理,極大地提高了檢測時限,為食品汙染的監測和食物中毒事件的快速反應提供了技術支持。
4結語
傳統的分離培養鑒定方法,即GB/T4789.30-2010作為各種檢測方法的基礎,目前已經和單增李氏菌顯色培養基以及API Listeria生化鑒定試劑盒聯合使用,較原來的國家標準方法有了很大程度的改進,不僅縮短了檢測周期,還大大簡化了檢測步驟,現已廣泛應用於微生物的檢測,同時作為其他方法的仲裁標準。但是,在檢測過程中發現,API Listeria生化鑒定試劑條主要依據10種生化反應,結果的判定主要依據顏色變化,因此若顏色變化不明顯或者不好界定時,其陰陽性判定帶有一定的主觀性。這是國標方法在檢測過程中的一個重要的局限性。免疫法不但經濟實用、重現性好,靈敏度和特異性也較強,特別是近幾年發展的免疫試劑盒,不僅適用於防疫及衛生技術檢測監督部門,還可在企業團體及日常家庭的衛生檢測中使用,是一種非常有希望普及的快速檢測方法。但是免疫法檢測需要開發相應的試劑盒,試劑成本會相應的提高,對於開展工作非常不利。另外,由於菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在,還難以進行李斯特氏菌種間特異分析。同時,李斯特氏菌屬與其他的細菌間存在共同抗原,給篩選特異性單克隆抗體帶來一定的困難。因此,用ELISA方法從增菌培養物中篩選李斯特氏菌,一般還需要在選擇性分離平板上劃線培養。
傳統的PCR檢測技術和常規檢測方法相比,由於特異性引物序列存在,大大增加了檢測的特異性和敏感性,同時也縮短了檢測時間,但尚存在著諸如同位素標記探針的放射性汙染、檢測步驟複雜、耗時長等許多不足,因此使其在實際檢測工作中的使用受到很大的限製。實時熒光定量PCR檢測技術,利用了PCR技術核酸擴增的高效性、探針技術的高特異性和光譜技術的高敏感性以及計量高準確性等優點,可精確定量、反應迅速、信號重複性好、靈敏度和特異性高,大大提高了定量的準確性。此外,由於是在封閉的體係中完成整個擴增和實時檢測過程,不需要凝膠電泳過程,從而縮短了檢驗時間,避免了擴增產物對環境造成的汙染問題。因此,利用傳統的分離培養結合分子生物學檢測,將是未來分析檢測發展的一個主要趨勢。
作者：劉書花 魏雲波 林小靜 李景超《現代農業科技》
5參考文獻
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