奶粉中阪崎腸杆菌分離株表型特征分類

阪崎腸杆菌(Enterobacter sakazakii)屬於腸杆菌屬的1個新種［1］。本文采用目前應用最廣、在微生物鑒定方麵得到公認的腸杆菌科細菌生化鑒定試劑(API20E)分析了阪崎腸杆菌的生化反應特性，並利用陰溝腸杆菌噬菌體進行裂解試驗測定了阪崎腸杆菌的易感性，對奶粉中18株阪崎腸杆菌分離株和4株美國典型菌種保藏中心(ATCC)參考菌株進行了表型分類。旨在對奶粉中阪崎腸杆菌分離株的表型特征進行分類，以便準確地對其鑒別。現報告如下。

　　1   材料與方法

　　11   材料   (1)標準菌株：阪崎腸杆菌ATCC29544，ATCC29004，ATCC51329，ATCC12868。(2)阪崎腸杆菌分離株：分離自國內市場奶粉抽查樣品，共18株。經AP120E和英國熒光快速微生物鑒定／藥敏分析儀，2種係統對阪崎腸杆菌的鑒定概率(％)。檢驗檢疫菌種保藏中心(IQCC)10403-1(984，9848)；10403-2(98，9489)；10403-3(984，9995)；10403-4(984，9230)；10403-5(98，9237)；10403-6(98，9935)；10403-7(984，993)；10403-8(984，9796)；10403-9(98，9726)；10403-10(984，9596)；10403-11(98，996)；10403-12(984，9926)；10403-13(98，9926)；10403-14(98，100)；10403-16(984，9951)；10403-17(98，9822)；10403-18(98，9935)；10403-23(98，996)。(3)試劑與培養基：腦心浸液肉湯(BHI)(美國Difico公司)；胰酪腖大豆腖瓊脂(TSA)、營養瓊脂(北京陸橋公司)；API20E(法國生物梅裏埃公司)；陰溝腸杆菌噬菌體(廣州虎克生物技術有限公司)。

　　12   方法

　　121   菌株培養   將每株參考菌株和分離菌株分別接種於滅菌BHI肉湯，36℃培養24h，再接種於TSA斜麵，36℃培養24h，作為儲備菌株，試驗時從儲備菌株用接種環接種於營養瓊脂，劃線分離37℃培養24h形成單菌落。

　　122   阪崎腸杆菌的生化特征及噬菌體裂解實驗   API20E實驗：將試驗菌株，按照API20E使用說明進行操作，36℃培養22～24h後，按照說明書滴加相關試劑，觀察和記錄結果。噬菌體裂解實驗：接種針輕點生長於營養瓊脂上的單個純菌落，通過管壁研磨使其均勻分散在2ml普通肉湯中，約100CFU／ml，取1接種環(約100μl)菌懸液塗布於經過預處理(90mm，20ml，放42～44℃恒溫箱30min使表麵幹燥)的營養瓊脂表麵，幹燥(同前)，取100μl陰溝腸杆菌噬菌體滴加於營養瓊脂表麵，36℃培養22～24h，觀察裂解結果，以融合裂解、不完全裂解和不裂解記錄實驗結果。

　　123   阪崎腸杆菌的表型特征分類   以ATCC參考菌株在API20E上反應的生化特征為生物1型，對於阪崎腸杆菌分離株，去掉相同的生化反應，保留不一致的生化反應項目進行分析，每1種與參考菌株不同的生化特性為1種新的表型。

　　2   結果

21   API20E測定結果   API20E共有21項生化反應，主要區別在於伏-普試驗(VP)、肌醇和山梨醇方麵，4株ATCC參考菌株生化反應一致，鑒定數值為3305373，7株分離株與參考菌株一致(389％)，將參考菌株的表型特征定義為生物1型，按照伯傑氏細菌手冊分類方法［2］，VP、肌醇、山梨醇分別為+、+、-，與生物1型相比，肌醇陰性為3株，比例為167％，為生物2型；VP陰性9株，比例為50％，為生物3型；山梨醇陽性2株，比例為111％，為生物4型；尿素陽性，1株，比例為5％，為生物5型；精氨酸陰性1株，比例為5％，為生物6型。

22   陰溝腸杆菌噬菌體裂解實驗   4株ATCC阪崎腸杆菌參考菌株和18株分離菌株經陰溝腸杆菌噬菌體裂解實驗，1株分離株被融合裂解，編號為IQCC10403-18，1株為不完全裂解，編號為IQCCl0403-13。

　　3   討論

　　1999年，Nazarowec-white和Farber對臨床和食品中分離到的17株阪崎腸杆菌以及1株ATCC29544進行了表型特征分類［3］，以ATCC29544參考菌株表型反應作為生物1型，與該生化反應模式比較，山梨醇陽性反應株列為生物2型，VP陰性為生物3型。 本實驗采用此方法，對22株(包括4株ATCC參考菌株)進行分析，但實驗結果存在差異。首先，ATCC參考菌株反應數值為3305373，而不是3304373，也即差異在VP實驗。本實驗4株參考菌株VP反應均為陽性，經典考夫曼方法重複實驗結果也為陽性，伯傑氏手冊中阪崎腸杆菌的VP反應陽性率為90%～100％［2］，臨床微生物學手冊為≥90％［4］。但本實驗的分離株VP陽性率為50％，這可能與VP實驗結果判斷臨界點有關。本實驗之所以進行陰溝腸杆菌噬菌體裂解實驗，是因為阪崎腸杆菌在1984年前屬於陰溝腸杆菌，包括參考菌株在內的22株菌，有2株分離株能被陰溝腸杆菌噬菌體裂解，這2株均產黃色素，API20E鑒定為阪崎腸杆菌的概率為98％，英國先德熒光快速微生物鑒定／藥敏分析儀鑒定為阪崎腸杆菌的概率>99％。此外，還出現尿素反應陽性和精氨酸反應陰性的阪崎腸杆菌菌株，在對阪崎腸杆菌的鑒別中值得注意。

 作者：趙貴明，仉慶文，蔡雪《中國公共衛生》

【參考文獻】
  　　〔1〕 Joshua B Gurtler,Jeffrey L Kornacki,Larry R Beuchat.Enterobacter sakazakii:A coliform of increased concern to infant health［J］.International Journal ofFood Microbiology,2005,104(1):1-34.　　
　　〔2〕 李蓉，徐迪誠.微生物分類和鑒定技術進展［M］.上海：光明日報出版社，1989：39-46.
　　〔3〕 M,Nazarowec-white,JM Farber.Phenitypic and genotypic typing of food and clinical isolates of Enterobacter sakazakii［J］.J Med Microbiology,1999,48(3):559-567.
　　〔4〕 徐建國，梁國棟，邢來君，等(譯).臨床微生物學手冊［M］.7版.北京：科學出版社，2005:678.

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